Gateway技术要点.docVIP

Gateway?技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 将您的基因转入到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一种更好的克隆方法??? Gateway?技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway?也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。 ? ??? Gateway?利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway?改造过的 的各种表达载体（目的载体）。??? 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。 图1-Gateway?技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。 一种强大而可靠的技术??? Gateway?技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。???Gateway?技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway?技术（表1和图2）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。??? Gateway?技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。需要了解更多的有关ccdB的信息，请参考术语表。 表1-反应和术语总结 反应 反应位点 产物 产物结构 BP反应 attB x attP 入门克隆 attL1-基因-attL2 LR反应 attL x attR 表达克隆 attB1-基因-attB2 完成构建Gateway?表达克隆仅需两步（图2）： 创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway? LR Clonase?酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。） 图2-Gateway?技术总结 ? ? 在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。 ??? ? 可以通过以下几种方法构建Gateway?入门载体。无论您选择何种方法，创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。图3-Gateway?定向TOPO?克隆PCR克隆（定向TOPO?克隆至入门载体或与供载体BxP重组） 限制性内切酶消化和连接进入入门载体 使用pCMV·SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway?兼容cDNA文库 Gateway?改造过的克隆资源* ( * 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Clonase?酶反应转换到入门载体。请登录/获得已有克隆资源的更多信息。)PCR-定向(PCR-Directional)TOPO?克隆??? 定向TOPO?克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生＞90％的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。??? 定向TOPO?克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率＞90％，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶。??? 目前有两种定向TOPO?克隆载体:pENTR/D-TOPO? 和pENTR/SD/D-TOPO?（表2和图3），它们具有有以下特点： 位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway?目的载体进行有效重组 通用M13位点便于测序 基于pUC的ori位点提供高产量质粒 大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选 表2-两种pENTR/D-TOPO?载体的简单比较 入门载体 特点 优点 pENTR/D-TOPO? 无SD(Shine-Dalgarno)位点 真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆