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质粒转化
实验26
质粒转化大肠杆菌
该实验主要有两个用途:
1.重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后,通常会发生质粒的重组失败,包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选,把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因,一旦重组成功,质粒环化(包括自身环化),抗生素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力,可以含该抗生素的培养基中生长传代,不然,重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。
2.为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟,而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝,因此,通过对转化成功的大肠杆菌培养,可以在短时内极大地扩增目的质粒。(作为分子生物学用大肠杆菌,是经过实验室改造过的工程菌。)
原 理
本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重组质粒,产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆菌的表面,在42℃的温度时,大肠杆菌出现热休克,质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后,加入LB培养液,于37℃振动培养可使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌落。
实验准备
天平、秤量匙、秤量皿
加热磁力搅拌器、搅拌子
可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头
经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架
定时器、记号笔、一次性手套和筒纸
42℃恒温水浴
4℃和-70℃冰箱
煤气灯或酒精灯
恒温培养摇床(调至37℃,225rpm)
37℃培养箱
玻璃涂棒(普通玻璃吸管,细头部在煤气灯上烧成“L”形)
消毒过的洁净培养皿(直径10cm)
二.试剂
LB培养基
细菌培养用胰化蛋白胨 10g
细菌培养用酵母提取物 5g
NaCl 5g 加800ml水,放入磁力搅拌棒,在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解,用5M NaOH(约0.2 ml)调节pH值至7.0,加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2(1.034×105pa)消毒30分钟,冷却后可加入氨苄青霉素(50mg/ml)500ul,视载体特性而定,混匀,即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。
含有琼脂的培养基
即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。
抗生素琼脂平板
待含有琼脂的培养基冷却后,加入抗生素,倾入培养皿,约30~50 ml,用煤气灯火焰掠过培养基表面,以消除气泡。冷却后,标记,封于塑料袋中,倒置,于4℃冰箱内避光保存。
pH试纸(或pH计)
三.实验材料
来源于实验一的重组质粒
受感态大肠杆菌
碎冰及碎冰保温盛器
实验步骤
自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌,插入湿冰中溶解约15分钟,轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管,并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌 50 ul
DNA 5 ul 轻轻混匀,静置冰上30分钟。
于42℃水浴中热休克细菌45秒,迅速移入湿冰中,静置2分钟,加入900ul LB培养液,放入37℃恒温箱摇床,225rpm摇晃培养1小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上,待干燥后,倒置,存放于37℃的培养箱中过夜。
次日,检查各培养皿中是否出现菌落。
实验结果
转化成功,培养皿中可见散在的菌落。
转化失败,培养皿上无菌落,或菌落布满如苔样,后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。
实验27 阳性单菌落扩增与小量DNA制备
目的
1.为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。
排除自身环化。鉴定方法主要有:
(1)PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR,一旦插入成功,则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。
(2)Southern blot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上,变性、固定,以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者,在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点,培养皿上对应的菌落即为重组成功者。
(3)酶切鉴定法及其利弊。
2.提供一定数量的DNA以满足一些实验,比如1)测序、2)准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。
有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似,区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀,而痕量乙醇,这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性,使后续的工作困难。
原 理
挑选单一菌落,培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌,用碱性液裂解细菌,再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物,离心后,此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀,而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上
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