质粒转化.doc

实验26 质粒转化大肠杆菌 该实验主要有两个用途： 1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。 2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。） 原 理 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。 实验准备 天平、秤量匙、秤量皿 加热磁力搅拌器、搅拌子 可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头 经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架 定时器、记号笔、一次性手套和筒纸 42℃恒温水浴 4℃和-70℃冰箱 煤气灯或酒精灯 恒温培养摇床（调至37℃，225rpm） 37℃培养箱 玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形） 消毒过的洁净培养皿（直径10cm） 二．试剂 LB培养基 细菌培养用胰化蛋白胨 10g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCl 5g 加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。 含有琼脂的培养基 即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。 抗生素琼脂平板 待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存。 pH试纸（或pH计） 三．实验材料 来源于实验一的重组质粒 受感态大肠杆菌 碎冰及碎冰保温盛器 实验步骤 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 50 ul DNA 5 ul 轻轻混匀，静置冰上30分钟。 于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落。 实验结果 转化成功，培养皿中可见散在的菌落。 转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。 实验27 阳性单菌落扩增与小量DNA制备 目的 1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。 排除自身环化。鉴定方法主要有： （1）PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。 （2）Southern blot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 （3）酶切鉴定法及其利弊。 2．提供一定数量的DNA以满足一些实验，比如1）测序、2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。 有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。 原 理 挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上