酶切、连接与转化.ppt

限制性酶切、连接与转化 一、酶切1、核酸酶的分类： 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；  核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。 ？ 如果内切酶可以切掉入侵的病毒DNA，为什么它们不会破坏宿主细胞自身的DNA 限制修饰系统 简称 R/M系统 restriction modification 类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外来的DNA，并使外来的DNA降解。 由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制性内切酶。 当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化核酸序列是限制性酶无法作用的。 2、 限制性酶切的原理： 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 I 型 II 型 III 型 功能 内切酶 甲基化酶 内切酶 内切酶 条件 ATP, Mg2+ Mg2+ ATP, Mg2+ 识别序列 EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT 回文结构 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 切割位点 离识别位点至少 1000bp 靠近或与识别位点一致 离识别位点24-26 bp 3、限制性核酸内切酶的类型和主要特征： 限制性酶切序列 5’ 突出末端 3’ 突出末端 + 平末端 粘性末端 粘性末端: DNA片段经限制性内切酶切割后, 在切割位点处所产生突出的5’-或3’-单链末端. 识别序列 限制性内切酶的特点 识别 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶识别 6 bp 发生的概率为 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp) 高度特异性 商业化生产 反应需要Mg2+ 不同的内切酶可能产生相同的末端 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 如 EcoRI 识别序列: 4. 影响核酸限制性内切酶活性的因素 （1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液 5、限制性内切酶的星号活性 Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因此第二活性又称星号活性。概括起来，诱导星号的因素有以下几种： 1,高甘油含量(5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高(100u/ug DNA)；3,低离子强度(25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等） 二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 常用的DNA连接酶有两种： 来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4DNA连接酶。 二者的作用机理类似。 T4连接酶作用分三步： T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。 (2) 酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的 DNA上，使DNA腺苷化。 (3) 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. T4DNA连接酶可连接DNA- DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。 影响连接效率的因素： A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值（载体DN