1.PCR引物设计及相关软件数据裤的使用答案.ppt

如附加限制酶位点，引入突变位点，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 * * 其中一个是：Melting temperature 一般情况下在这个窗口上工作。 编辑上游引物，输入上游引物在模板上结合的位置 1. 上游引物位置.. 163bp-183bp，与模板结合的位置为163-1的位置，输入162. 2. 上游与模板结合后，序列是完全一致的。 1. 下游引物位置.. 307bp-327bp，与模板结合的位置为307的位置. 2. 下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。 引物分析 Hairpin Dimer and cross Dimer GC% Total PCR information 1. 检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。 2. 发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好 3. 检查为GC 含量，以45-55％为宜 4. 检测与PCR其他模板上错配的位置。 1. 引物二聚体分析 2. 引物发夹结构分析 3. 引物GC比值分析 4. 引物在模板上错配概率 下游引物分析结果 Primer Premier 5.0使用介绍 Primer Premier 5.0使用介绍 主要功能：用于引物的检索 Preimer Premier 启动界面 Load sequence Choose a function 第一步. 输入基因的序列 第二步.搜索上下游引物在基因序列中适合的位置。 第三步.引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 13个引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 第四步，选择引物搜索的结果 第五步.检测软件设计的引物 是否出现引物自身发夹结构，二聚体，错配位点等 上游引物搜索结果 下游引物搜索结果 第六步，获取引物信息 引物及产物信息 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 … 引物设计软件小结 PCRDESIGN （分析评价引物的功能，简单方便） Oligo 6.0 （分析评价引物功能，最优秀） Primer Premier 5.0 （自助搜索引物的功能） Oligo 6.0与Primer Premier 5.0 搭配使用，可快速设计出成功率高的引物。 引物特异性检测 设计PCR引物后，需要对引物的特异性进行检测。 检测引物是否能与基因组或cDNA数据库中其他位置结合，扩增出非特异性条带。 —Primer Blast Primer-BLAST可以直接从Blast主页进入： （/） Primer Blast也可以直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/ 提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区） 1. 在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。 输入验证引物 根据需要设置外显子与内含子选项 在specificity check区： 4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome, and nr；多个物种（人，鼠） 。 Primer-blast 软件检测结果 检测结果显示： HMGB2基因虽然有相似区，但是3’端没有完全互补，因此该引物只能特异性地扩增HMGB1基因，不能扩增出HMGB2基因。 Primer-blast 软件检测结果 下 午 序列查找及引物的设计 教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引物（13：30-15：00） 下课的时候交设计的引物结果 （需要个人笔记本电脑） 根据不同的实验目的设计引物，比如全长，部分 每个小组以PPT/word的形式汇报 （15：00-16：00） 占总成绩的15% 汇报自己查找的序列及设计的引物 总结自己所遇到的问题及解决方法，与他人分享 占总成绩的15% The mRNA sequence of Homo sapiens interferon, alpha 1 is as followed: 1 agaac