细胞培养及材料细胞毒性检测要点.pptVIP

物 品 湿 热 干 热 过 滤 紫 外 化学 气体 消毒剂 电离 辐射 培养室 工作台 ＋ ＋ ＋ 玻璃 制品 ＋ ＋ ＋ 金属 器械 ＋ ＋ ＋ ＋ 塑料 制品 ＋ ＋ ＋ 橡胶 制品 ＋ ＋ ＋ ＋ 培养 用液 ＋ ＋ 布类 棉类 ＋ ＋ 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。 4.细胞培养的基本方法 粘着、粘附 （attachment） 铺展 （spreading) 1）取材 → 切割 组织块培养法 消化培养法 2）直接购买 → 培养 （原代培养） 传代 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 弃去旧培养液 → 清洗 → 加入消化液 → 吸弃消化液 →加入培养液 → 吹打分散细胞 → 分装稀释细胞 → 补加培养液 → 继续培养 接种数量为5×104～8×105个/ml。 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。 游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性 肉眼观察：培养液的颜色和透明度 显微镜观察 生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，轮廓不清 生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落；有时细胞表面及周围出现丝絮状物 每毫升细胞数 血细胞计数板 细胞生长曲线 贴壁率 有丝分裂指数(MI)：分裂相数量占全部细胞数量的百分比 细胞群体倍增时间 四唑盐(MTT)比色法 标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入量 细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比 台盼蓝法 四唑盐(MTT)比色法 荧光素双乙酸酯法(FDA) 四唑盐（MTT）比色法 MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。 细胞大小：显微测微计法 细胞重量：称重法 鲜重 干重 细胞固定 苏木精-伊红染色 Giemsa染色 Feulgen染色 考马斯蓝染色 免疫法 细胞核染色：Hoechst、DAPI 混浊、pH异常改变、细胞外形模糊、漂浮的集落 细胞出现增殖缓慢或死亡 化学物质的污染 非同种细胞污染 微生物污染：细菌、真菌、支原体、病毒 5.细胞培养的污染和检测 培养液变黄，出现浑浊 镜下可见圆球状颗粒漂浮 预防和处理：青霉素、链霉素 培养液一般不浑浊 白色或黄色小点漂浮于培养基表面 光镜观察到菌丝 预防和处理：抗真菌剂 可透过滤膜 无细胞壁 细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 预防 重新培养 鉴别 清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养法、重新克隆法、动物体内接种除菌法 防止交叉污染 慢冻快融 低温保护剂：10%的甘油或二甲亚砜DMSO 细胞深低温保存的基本原理： -80℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字母或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解。 HeLa：为供体患者的姓名(Henrietta