孙中贯--发酵工程实验教案-2012级要点.docVIP

生物工程技术实验发酵工程部分实验讲义 微生物生长曲线和产物形成曲线的测定 一实验目的 1了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。 2学习微生物生长曲线和产物曲线的测定方法。 二实验原理 将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜的条件下培养，定时测定培养液中微生物的生长量（吸光度或活菌数的对数），以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线，它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培养条件而异。因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生产实践都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种方法，如血球计数法、平板活菌计数法、称重法、比浊法等，本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸光度(A) 成正比也称光密度比浊法，只要用分光光度计测得菌液的A后与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线，此法快捷、简便。 产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。工业发酵的目的是为了收获产物，因此必须搞清产物积累最高时所需的发酵时间。如果提前终止发酵，营养物质还没有完全被利用，发酵液中的产物量偏低；如果发酵时间过长，一方面产物可能会分解，另一方面也降低了设备利用率。因此，学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重要的指导意义。 三实验器材 1菌种 酿酒酵母 2培养基 葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母膏2% 3器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、分光光度计、恒温培养箱、酒精计 四实验步骤 1生长曲线的测定 配制培养基，250mL三角瓶装100mL培养基，一共28瓶，0.1MPa灭菌20min，备用； 菌种活化：活性干酵母1g，100mL2%的蔗糖溶液中(35~38℃),摇匀，置于30~32 ℃恒温箱中活化1~2h，即得1%的ADY活化液。 吸取2mL活化液接入装有100mLYPD培养基的三角瓶中； 将三角瓶放入恒温培养箱中，35℃培养144h； 每隔12h拿出2瓶（包括0h），以不接种的培养基作对照，在560nm处测吸光度，离心测菌体浓度，填入表中， 以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，作生长曲线。 2产物形成曲线的测定 24h后，每隔12h取出2瓶，在进行生长量测定的同时，进行产物形成量的的测定，以培养时间为横坐标，产物形成量为纵坐标，作出产物形成曲线； 培养时间对菌体生长量和产物形成量的影响 培养时间/h 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 A560 菌体浓度/% 酒精度/%体积分数（20℃） 五注意事项 1各瓶的接种量、培养条件应一致。 2若吸光度太高，可适当稀释后再测定。 3因培养液中含有较多的颗粒性物质（包括菌体），测吸光度时应马上读数，否则，颗粒沉淀，影响测定结果。稀释10倍后测定是可行的办法。若要精确测定，可用活菌计数法，在营养琼脂上观察生长的菌落数，但应掌握好稀释倍数。 六思考题 1如果每次从同一摇瓶中取出1mL进行测定，会对结果产生怎样的影响？ 2比较生长曲线与产物形成曲线，从中可以得出哪些结论？ 3测定生长曲线时，除了本实验所用的分光光度计比浊法外，还有哪些方法？它们各有哪些优缺点？ 四、工业微生物的筛选、分离纯化及发酵生产（综合设计型） α-淀粉酶发酵（综合设计实验） 1.实验目的 学习、掌握α-淀粉酶发酵原理、发酵操作技术及淀粉酶活力的测定方法。 2.实验原理 α-淀粉酶，是以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开α-1,4葡萄糖苷键，使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。其产物的还原性末端葡萄糖残基C1碳原子为α构型，故称α-淀粉酶。 α-淀粉酶被广泛应用于食品、医药、发酵、制糖及防治等工业，也是目前国内外应用最广、产物最大的酶种之一。目前其合成机理多发生在发酵的对数生长期，并受分解代谢遏制的调节。其容易利用的碳源有蔗糖、葡萄糖、果糖等，这可以促进其细胞的呼吸和生长，但不利于产酶，代谢愈快的糖对产酶的抑制愈严重；反之，一些能源利用性差的糖类，如糖原、乳糖、半乳糖、棉籽糖和木糖等对生长不利，却能促进产酶。 3.实验材料 （1）菌株 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BF7658 （2）培养基 ①斜面培养基（g/L）：可溶性淀粉20，蛋白胨10，NaCl5，琼脂20，pH6.7~7.0,121℃灭菌20min。 ②摇瓶培养基（g/L）：豆饼粉40(过4