食品生物技术导论要点.docx

食品生物技术：是现代生物技术在食品领域中的应用，是指现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料基因工程：又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品基因工程的理论基础：1、不同基因具有相同的物质基础2、基因是可切割和转移的3、多肽与基因之间存在对应关系4、基因的遗传信息是可以遗传的基因工程的主要内容：1、在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒、病毒或噬菌体）2、把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接组成重组体3、把重组体引入宿主细胞4、筛选、鉴定出含有外源目的基因或个体工具酶：限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶Ⅰ型限制性内切酶：不能专门切割DNA的某个特殊位点（未大量使用）Ⅱ型限制性内切酶：可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段（广泛应用）同裂酶：来源不同，具有相同的识别序列同尾酶：识别序列不同，切割后，具有相同的DNA黏性末端Ⅲ型限制性内切酶：具有独特的识别方式和切割方法，如MboⅡ基因载体：质粒（能自主复制的双链DNA分子，在细菌中独立于染色体之外存在：①具有复制起点②相对分子质量尽可能小③有单一的限制性内切酶识别位点④有一个或多个选择标记基因）、植物病毒、噬菌体理想的基因工程载体具备的特征：能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在外源DNA插入其DNA复制的非必需区内，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性易于从宿主细胞中分离，并进行纯化有适当的限制性内切酶单一酶切位点具有能够直接观察的表型特征质粒载体pBR322：大小为4363bp，含有两个抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素和抗四环素），还有单一的Bam HⅠ、HindⅢ和SalⅠ的识别位点，这三个位点都在四环素抗性基因内；另一个单一的PstⅠ识别位点在氨苄青霉素抗性基因内质粒载体 pUC19：pBR322带的单一克隆位点较少，筛选程序较费时，pUC19是在其发展的，有一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因（lac Z’）的调节片段，一个调节lac Z’基因表达的阻遏蛋白的基因lacⅠ，还有多个单克隆位点酵母质粒载体：既可以在大肠杆菌中复制，又可在酵母系统中复制，又称穿梭载体噬菌体载体：细菌病毒聚合酶链式反应法（PCR）：PCR模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的快速聚合及扩增。能快速、简便地在体外扩增特定的DNA片段，具有高度的专一性和灵敏度。过程：变形→退火→延伸，如此反复进行约30个循环。条件：①要有与被分离目的基因的DNA双链两端序列相互补的DNA引物（约20个碱基）②有热稳定性的酶③dNTP④作为模板的目的DNA序列⑤反应缓冲液克隆：将重组DNA导入受体细胞进行扩增和筛选，达到大量的重组分子，即外源基因的无性繁殖重组DNA导入受体细胞的方法：转化：将重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程为转化转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（又分为磷酸钙沉淀法与体外包装法）微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法电转化法：用到电转移微弹技术：也叫高速粒子轰击法或基因枪技术脂质体介导法：其他方法：加速冷冻法、碳化硅纤维介导法受体细胞：能摄取外源DNA并使其稳定保持的应用价值或理论研究价值的细胞选择受体细胞应考虑：①安全性②便于重组DNA 分子的导入③便于筛选克隆分子④重组DNA分子在受体细胞内并能稳定维持⑤适于外源基因的自主表达、分泌或积累重组体的鉴定：报告基因的检测法：指在构建目的基因时将一种报告基因（如GUS、NPTⅡ、CAT、NOS、OCS、LUS、GFP）构建在一起，当目的基因转化受体细胞时，报告基因一同被转入（这种报告基因是受体细胞本身不存在的，而且具有易于检验的表型转基因生物的PCR鉴定：以被检测的DNA为模板，在外源基因的两侧设计合理的引物，通过PCR反应进行扩增，然后通过凝胶电泳分析扩增产物目的基因分子杂交检测方法：利用表达稳定、易于检测的报告基因的表达来间接地证明目的基因的存在与表达，若需进一步证明目的基因的存在、转录及表达程度，需用分子杂交方法来检测RNA沉默：指在真核生物（植物、动物、真菌）中保守的由双链RNA诱导的鉴定和破坏其细胞质中异常变异或过表达的RNA的一种机制。是广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生中的一种高度保守的、序列特异的 RNA 降解机制. RNA 沉默对于调控发育、维持基因组的稳定性以响应生物和非生