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MTT实验研讨

MTT实验 ----检测细胞活力、细胞增殖能力和细胞毒性 刘畅 2014.3.26 细胞周期的变化肉眼不可见,如何比较不同细胞增殖的快慢呢? 1.化疗药物不仅作用于癌细胞,也会杀死体内正常细胞,如何经济地检测某种化疗药物的毒性和适宜浓度? 2.大规模的筛选抗肿瘤药物,耗时费钱,有没有经济快速的方法进行抗肿瘤药物体外筛选? 3.人体内一些microRNA与细胞增殖密切相关,可以作为癌症早期诊断的分子标记,那么如何用体外实验证明这些microRNA在细胞增殖中的作用? (如:miR-29c在鼻咽癌组织中表达量低于癌旁正常组织,推测miR-29c能够抑制鼻咽癌细胞增殖,可进行MTT实验验证推测。) Scientific questions MTT实验 Introduction of MTT 3-(4,5)-dimethylthiahiazo?(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 -20℃储存,需避光(锡箔纸包裹), 分装避免反复冻融。 MTT有致癌性,用的时候小心, 带手套。 配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感。 MTT法原理 MTT比色法:一种检测细胞存活和增殖能力的方法 原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪490nm波长处测定其吸光值,可间接反映活细胞数量。 在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 MTT 甲瓒 SDH DMSO 490nm测定OD值 MTT实验步骤(示例:miR-29c对细胞增殖的作用?) 6孔板转染24-48h后收细胞 吸取10uL于细胞计数板中计数,计算所需细胞总量 96孔板中每孔加入200 uL细胞液,约1000个细胞 12h细胞贴壁后,每孔加入20uL 5mg/mL MTT,轻晃混匀,37℃培养4h,封口 移去上清,每孔加入200uL DMSO(需避光),脱色摇床轻摇10min 酶标仪(490nm波长)测每孔OD值 6孔板细胞种板及转染 长至80%左右收细胞 各孔加1.75mL培基+0.25mL细胞悬液,轻吹混匀(十字交叉平移法+顺逆时针各10圈) 种板 转染 Opti-mem 125 uL Lip 2000 5 uL mix1 Opti-mem 125 uL DNA 1 ug mix2 5min 5min 25min 培养12-24h,吸去6孔板中培基,加入1.75mL新鲜培基+250uL DNA 24-36h开始做MTT实验 MTT实验步骤(示例:miR-29c对细胞增殖的作用) 6孔板转染24-48h后收细胞 吸取10uL于细胞计数板中计数,计算所需细胞总量 96孔板中每孔加入200 uL细胞悬液,约1000个细胞 12h细胞贴壁后,每孔加入20uL 5mg/mL MTT,轻晃混匀,37℃培养4h,封口 移去上清,每孔加入200uL DMSO(需避光),脱色摇床轻摇10min 酶标仪(490nm波长)测每孔OD值 MTT实验—96孔板加样 比较转入miR-29c的细胞和空载细胞6d中的增殖能力,各做5个重复。 边缘各孔加200uL hanks液,防止蒸发。 30*200uL=6mL 30*1000=30000个 MTT实验步骤(示例:miR-29c对细胞增殖的作用) 6孔板转染24-48h后收细胞 吸取10uL于细胞计数板中计数,计算所需细胞总量 96孔板中每孔加入200 uL细胞液,约1000个细胞 12h细胞贴壁后,每孔加入20uL 5mg/mL MTT,轻晃混匀,37℃培养4h,封口 移去上清,每孔加入200uL DMSO(需避光),脱色摇床轻摇10min 酶标仪(490nm波长)测每孔OD值 MTT实验结果处理 结果记录 结果处理 Graphpad 大规模的抗肿瘤药物及其适宜浓度的筛选 MTT实验应用 细胞毒性试验 MTT实验应用 此外,MTT实验也应用于生物活性因子的活性检测、肿瘤放射敏感性测定等。 特点:灵敏度高、经济。 谢 谢!

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