第三章细胞破碎与分离技巧.pptVIP

3.1 概述 胞外产物 霉菌产生糖化酶等 胞内产物 基因重组产品等 分离纯化方法： ⑴ 使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外 ⑵ 细胞破碎 物理法，化学法，机械法，酶法 不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培 养液中。 植物细胞：多为胞内产物。 微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数 大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。 对于胞内产物，首先必须将细胞破碎。 3.2 细胞壁的结构及组成 细胞壁的化学组成： 微生物的类型 年龄 生长生理学 3.2 细胞壁的结构及组成 3.2 细胞壁的结构及组成 3.3 细胞壁的破碎 破碎方法的选择： 破碎目的 待破碎生物体的类型 破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗； 研究胞内产物在体内的功能，宜 采用软处理。 待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不 同的敏感度 3.3 细胞壁的破碎 3.4 细胞破碎技术的分类 几种细胞破碎方法的比较 3.4.1 破碎率的评价 破碎率的定义： N0：原始细胞数 N：经t时间操作后，保存下来的细胞数 N0 和N的获取： 直接计数法（平板计数，显微镜计数） 间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量） 电导率测定法 电导率测定法：细胞破碎后，大量带电 荷的物质被释放到水相，使电导率上升 ，电导率随破碎率的增加呈线性增加。 由于电导率与微生物的种类，处理 条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解 质含量有关，因此，正式测定应采用其 它方法测定标准曲线。 3.4.2 破碎方法 图3.4 珠磨机简图 3.4.2 破碎方法 原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。 珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体 一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为 立式机中向上流动的液体在某种程度上会 使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。 研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化 锆(密度为6.0 g／cm3)微球(粒径约0.1～10mm)，填充率为80％～85％。 3.3.2 破碎方法 动力学方程：遵循一级动力学方程 3.4.2 破碎方法 影响破碎效率的因素： 转盘外缘速度 细胞浓度 珠粒大小及装载量 温度 流速 影响破碎效率的因素 转盘外缘速度： 在一定范围内，破碎的比速率与外 缘速度成正比 影响破碎效率的因素 转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加， 但产生的热量和消耗的功率也增加。破碎 效率E被定义为： 影响破碎效率的因素 细胞浓度： 影响悬浮液的流变特性，从而影响 蛋白质的释放，一般由实验确定 一般控制在40％左右，细胞湿重/体积 影响破碎效率的因素 珠粒大小及装载量： 过少不，不易破碎 过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高，不利搅拌，一般控制80％～90%. 影响破碎效率的因素 温度： 热稳定性，目的产物不受破坏 夹套冷却 影响破碎效率的因素 流量： 影响破碎效率的因素 微生物类型： 酵母较细菌在珠磨机中更易破碎 ，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞 的十分之一，在高速珠磨机中不易破碎。 影响破碎效率的因素 影响破碎效率的因素 延长研磨时间，增加珠体装量，提高基 本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率 ，使能耗加大。同时: 1、产生较多热能，增加冷却控温的难度； 2、大分子目的产物失活增加 3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续操作带来困难。 因此,破碎率控制在80％以下。 3.4.2 破碎方法 图3.3 HC23-高压细胞破碎机 作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50～70MPa。 3.4.2 破碎方法 动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素 主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率 X与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表 达为：（服从一级反应规律) 3.4.2 破碎方法 影响细胞破碎的因素： 温度 压力 循环操作次数 细胞浓度 阀座形式 影响破碎效率的因素 温度： 破碎率随温度的增加而增加 例如：操作温度由5℃增加到30℃