实时荧光定量PCR技术的原理及应用,注意事项,适合菜鸟入门技术总结.pptxVIP

汇报人：朱林林 2011/03/25 实时荧光定量PCR技术 目录 实时荧光定量PCR基本原理 实时荧光定量PCR的实验设计 实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较 实时荧光定量PCR误差分析及操作规范 实验中污染的防控 荧光定量PCR报告模板 实时荧光定量PCR基本原理 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板进行定量分析。 常规vs实时 优缺点比较 定量PCR三个基本概念 (1)扩增曲线 PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。 定量PCR三个基本概念 (2)阈值的概念 在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。 定量PCR三个基本概念 (3) CT值 PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。 C(t)与初始模板含量 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系 荧光定量PCR的定量原理 浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量。 荧光定量PCR的化学原理 化学方法分类 非特异性 SYBR Green I法 特异性 TaqMan探针法 SYBR Green I法 原理：结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度 优点 使用方便，无需复杂的设计 成本较低 缺点 与非特异性产物结合，无模板特异性 试验方法较难优化 灵敏度低 SYBR Green I法溶解曲线分析 荧光染料的特点及应用 (1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高； (2)、可做双链核酸的熔解曲线分析； (3)、SYBR GreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStar Taq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时； (4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛； (5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。 (6)、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。 TaqMan探针法 水解型 报告基团，淬灭基团 FRET（荧光谐振能量传递） 识别特异性产物 优点 特异性高，可准确定量 灵敏度高 设计不同标记的探针，可进行多重检测 缺点 一个探针只适用于一个目标 价格较高 探针设计较繁琐 TaqMan作用机理 两种化学的比较 实时荧光定量PCR的实验设计 绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA） 相对定量：计算初始反应模板的相对含量 定量PCR--绝对定量 标准品，标准曲线 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线 样品 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值 定量PCR--相对定量 相对定量的目的 比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别 内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差 实时荧光定量PCR两种相对定 量方法比较 相对标准曲线法和2-ΔΔc(t) 法 相对标准曲线法 用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线 处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值 用内标基因对目标基因均一化 处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异 适用范围 目标基因与内标基因扩增效率差异较大 扩增效率较低 2-ΔΔc(t) 法 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：