第三章--植物组织培养2.pptVIP

第三章 植物组织与器官培养 植物组织培养的基本过程 1).培养材料的选择与采集 2).培养材料的预处理 3).制备外植体 [诱导愈伤组织 悬浮培养 诱导胚性组织] 4).接种和培养 5).根的诱导 6).炼苗移栽 接种 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。 无菌操作可按以下步骤进行： (1) 在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌; （2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯; （3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等; （4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面; 　　 （5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干; （6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等; （7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。 无菌接种步骤： 　　（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。 　　 （2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 　　 （3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 具体操作过程（以试管为例）是： 先解开包口纸，将试管水平放置，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞后，再用火焰灼烧管口附近区域。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。 材料放置方法:除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他无统一要求。 接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞塞好，包上牛皮纸，牛皮纸内面也要过火。 培养 培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件、无菌）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1、培养方法 　（1）固体培养法 　即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 　　 （2）液体培养法 　　即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给。 采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 2、培养步骤 （1）初代培养 旨在获得无菌材料和无性繁殖系。 　初代培养即接种某些外植体后，最初的数代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。 初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。 根据初代培养时发育方向可分为： 1）顶芽和腋芽的发育 　　采用外源的细胞分裂素，可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。 一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。 适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。 　　用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽,形成芽从。