第三章微生物菌种选育.pptVIP

第二轮诱变（第一轮的五株菌株）： 方法和步骤与第一轮相同，将初筛出的5株菌株全部进行诱变处理。 每一菌株第二轮诱变后，平板分离，挑取40个单菌落，共挑取菌落40×5个 摇瓶初筛选出50株 摇瓶复筛选出5株； 若产率不高，还必须进行第三轮诱变育种。 3)菌种特性考察 ①菌株稳定性试验:传代10代以上。考察变异株产率是否发生较大的变化。 ②菌种其他特性考察 4）中试验证 5）大型投产试验 经过上述实验，获得的高产菌株，方才可用于工业上大规模生产。 菌种育种举例 从土壤中分离、诱变及随机筛选柠檬酸高产菌种选育过程。 一、从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株 1、确定筛选产柠檬酸的菌种种类，采集样品： 取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。 2、选择合适的培养和纯种分离的方法： 固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉，在平板培养基中添加碳酸钙，待培养长出菌落后，挑取透明圈大的菌落于斜面。 3、挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的测定：即确定所筛选的黑曲霉菌株产的是柠檬酸。 二、菌种的诱变育种 1、将黑曲霉接种于斜面活化； 2、制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数； 3、诱变剂处理： 可先单一，后复合处理： 1）物理因子：紫外线诱变和γ射线诱变处理； 2）化学因子：硫酸二乙酯、亚硝基胍处理； 3、用加碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢子，待菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的单菌落200个于斜面培养基，300C培养长出孢子后，进行摇瓶初筛。 4、摇瓶初筛： 5、摇瓶复筛： 若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种。 三、变异株稳定性试验： 转接10代，考察传代后，各代菌株柠檬酸生产率是否有较大的变化； 四、菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产生孢子的情况进行考察； 五、中试验证菌种是否适合工业化生产； 六、大型投产试验，进行工业化生产 。 六、杂交育种（Hybridization breeding） 1、杂交育种定义： 指两个不同基因型的生物通过结合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选到具有新形状的菌株。 人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、 F因子转导、转导和转化等过程, 使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组, 以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段, 比起诱变育种, 它具有更强的方向性和目的性。 细菌杂交育种 在细菌中实现杂交的种类主要是大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。 大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。 F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。 F因子有明显感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。 酵母杂交 运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。 酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。 2、原生质体融合育种 用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和钎维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 原生质体融合育种的特点 ① 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 ② 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 ③ 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 ④ 有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 ⑤ 提高菌株产量的潜力较大。 ⑥ 有助于建立工业微生物转化体系。 原生质体融合步骤： ①标记菌株的筛选:营养缺陷型和抗药性标记 ②原生质体的制备：脱壁酶脱壁 ③原生质体的融合：聚乙二醇促进融合 ④原生质体的再生：再生培养基培养再生壁 ⑤融合子的选择：选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 ⑥生产性能筛选。 ①标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实