常用分子生物学技术.ppt

一、分子杂交与印迹技术的原理 DNA变性： 双链DNA在各种理化因素作用下变为单链的过程。 本质是碱基对之间的氢键断裂。 DNA复性： 去除变性条件，变性DNA重新形成双链的过程。 常用变性条件： 加热 分子杂交： 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成杂种双链的过程。 分子杂交的目的： 检测DNA和RNA 探针： 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的核苷酸链。 增色效应： DNA变性伴随260nm吸收值增高 减色效应： DNA复性伴随260nm吸收值降低 原因： 硷基中共轭双键的暴露 Tm值: 分子杂交的方法 : （固—液杂交） 1. 斑点杂交： 提取DNA或RNA，直接点在硝酸纤维素膜上，和探针杂交 检查有没有你所要的DNA或RNA 反向斑点杂交 固相：多种探针序列 液相：一种待测样品(标记） DNA点阵： 将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，检测DNA或RNA和那一个探针杂交。 待检样品进行标记 一种样品多种探针 基因芯片： 将更多的探针排列在硅片上，借助计算机检测未知的DNA或RNA和那一个探针杂交 2.原位杂交 组织固定技术与分子杂交技术结合 组织切片或细胞涂片原位杂交： 将DNA或RNA在组织切片和细胞涂片中变性和固定，和探针杂交 确定DNA或RNA在组织和细胞中的定位。 菌落或噬菌斑原位杂交： 基因工程中筛选阳性克隆。 Western Blotting常被用来检测基因表达 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 用于检测在mRNA 水平上的基因表达差异 要防止扩增效率不同产生的误差 要管家基因作内对照 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 固定组织或细胞 蛋白酶K消化处理 PCR扩增 原位杂交 显微镜观察结果 反向PCR 逆转录PCR 原位PCR 重组PCR 不对称PCR 多重PCR 一、生物芯片的概念 指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统， 以实现对组织细胞中DNA、蛋白质及其他生物组分的快速、高效、敏感地处理与分析。 生物芯片（biochip） 信息芯片： 将与生命相关的信息分子高度集成，来实现对基因、蛋白等生物活性物质进行高通量的检测与分析 基因芯片（ DNA芯片） 蛋白质芯片 组织芯片 细胞芯片 功能芯片（微流体芯片） 在芯片上完成生命科学研究中样品的分离、扩增、生化反应等功能 生物样品制备芯片 核酸扩增芯片 毛细管电泳芯片 基因芯片技术的应用领域 (二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激活因子结构与功能的认识 报告基因 在GAL4结合的顺式作用元件下游需连接报告基因。 目前应用最多的报告基因是LacZ基因，表达后能在X-Gal培养基上产生蓝色菌落。 其次是His基因，表达后能使酵母菌在缺少组氨酸的培养基中生长。 现在多提倡两种报告基因同时应用，颜色筛选和营养缺陷筛选同时进行，以降低假阳性的出现 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone