7重组体克隆的筛选和鉴定详解.ppt

蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹(immunoblotting) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 Western Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 一、无细胞翻译系统 第六节 转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 二、转译筛选 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性 带纹的位置 载体+外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符？ 三、杂交抑制转译法 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 2. 过程 四、杂交释放转译法 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。 2. 过程 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA编 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 ④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。 dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉 抑制 抑制 ① HAT培养基： Tk- 细胞株。 TK基因。 ② 宿主细胞 ③ 载体标记 （2）TK选择过程 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） 只有转入TK基因的细胞才能生存。 20 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） （1） 选择原理 ①二氢叶酸还原酶的必要性 dUMP dATP TTP dCTP 四氢叶酸 四氢叶酸 DHFR+细胞 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸 DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 不需要补救！ DHFR- 细胞 DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。 需要补救！ 不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 dUMP d