WesternBlot全攻略课件.ppt

?Western Blot原理 ?Western Blot流程 ?Western Blot常见问题 ?Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 ? Western Blot 可以： 1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质； 2.定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况； 3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。 ?若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal（激光共聚焦）应是首选的方法。 ?若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术（IP或co-IP）。 ?蛋白样品的制备 ?SDS?转膜 ?封闭 ?一抗杂交 ?二抗杂交 ?底物显色 ? SDS电泳 ? 转膜及抗体检测 ?胶不平？ ?凝胶漏液？ √胶板洗刷干净 √加入AP和TEMED的量要合适 √加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 √温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 √两块玻璃板底部要对齐 ?条带比正常的窄？ ?“微笑”或“倒微笑”条带？ √ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 √拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 √样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 √胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 ?凝胶肿胀或卷曲？ ?条带歪