miR96介导FOXO3表达变化对肺腺癌细胞A549增殖和凋亡影响.pdfVIP

摘要 nl i R-96介导的FOX03表达变化对肺腺癌细胞A549增 殖和凋亡的影响 硕士研究生：陈腾飞 导 师：张国俊 郑州大学第一附属医院 河南郑州450052 摘要 背景 目前，在世界范围内，肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，它的 病理类型主要分为两种：一是进展速度较快的小细胞癌(small cell lung carcinoma，SCLC)，占总体比例的13—15％左右，二是非小细胞癌(non—small cell lung carcinoma，NSCLC)，包括腺癌、鳞癌，大细胞癌，神经内分泌癌等，占总 体比例的85％左右，其中腺癌是发病率最高的肺癌。导致肺癌预后较差的原因有 很多方面，大部分患者发现肺癌时已处于晚期是预后差的关键因素之一，因此 早期发现和手术仍然是治疗效果最好的措施。对于中晚期的肺癌患者，主要的 治疗手段有化学药物治疗、放射性治疗、生物靶向治疗等。这些治疗手段有一 定的疗效，但患者耐受性差、副作用大、容易复发，特别是化学药物治疗、放 射性治疗。肺癌的浸润和转移也是影响患者疗效和生存时间的关键因素，明确 的发病和转移机制目前仍然不清楚，因此缺乏有效的治疗手段。由于肺癌发病 率高，预后差，目前缺乏有效的治疗手段，积极探索肺癌发发展的生物学机制， 对于早期诊断、减少复发和转移，以及治疗肺癌的新方新策略均具有现实意义。 微小RNA，即microRNA(miRNA)，是由22个左右的核糖核苷酸组成的非编 码、小分子单链RNA，在物种间和进化上具有高度保守性，几乎所有的真核细胞 生物都可以表达。MicroRNA以完全或者不完全互补结合的方式与mRNA的3’端 非编码区(3’-UTR)相互作用，促进mRNA降解，抑制mRNA翻译。MicroRNA对 很多基因都有调控作用，在细胞的生长发育、分化、增殖、凋亡、细胞周期等 T 摘要 细胞生物学行为都起着十分重要的作用。近年越来越多的研究发现，在很多肿 瘤组织和肿瘤患者血清中，miRNA有过表达或者低表达的现象，并且绘制了不同 肿瘤组织的miRNA表达谱。进一步的研究表明，miRNA在肺瘤发生、发展及转移 发挥重要作用。miRNA一96是miRNA一183家族(miRNA-96，miRNA-182，miRNA一183) 成员，在进化上高度保守，位于人类7号染色上。FOX03属于FOXOs家族(FoxOl， Fox03，Fox04 and Fox06)，这一类转录因子的特点是鲜明的叉头DNA结合域。 FOX03的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，癌症中常见的是FOX03基因的 下调，因此FOX03被称为肿瘤抑制器。生物学信息分析FOX03的3’一UTR具有2 个序列保守的miRNA一96的结合位点，结合后抑制FOX03的表达。在人乳腺癌组 织中和乳腺癌细胞系中高表达的miRNA一96通过下调转录因子FOX03起到促进肿 瘤细胞增殖的作用。在人肝细胞癌中miRNA-96的表达抑制可以增加FOXOI、FOX03 的表达水平，以此减少肝癌细胞系的增殖和集落形成。在非小细胞肺癌 (non—small cell lung carcinoma，NSCLC)组织和相应患者血清中，已有证实 miRNA一96持续和显著高表达。Wangyu Zhu等人利用70对NSCLC组织和相匹配 的癌旁组织、44例正常人血清样本，验证了miRNA-183家族(包括miRNA-96) 在癌组织中、患者血清中高表达，并且在肺腺癌细胞系A549、H1299、SPC-A1， 肺小细胞癌细胞系NCI—H466，肺大细胞癌细胞系NCI-H460中表达增高。miRNA-96 在NSCLC组织中及血清中研究报道较多，但在细胞水平及其下游作用靶点国内 外研究较少。 目的： 探讨miRNA一96对人肺腺癌细胞系A549增殖和凋亡能力的影响及其对FOX03 的调控作用。 方法： 1．细胞培养及miRNA～96 inhibitor设计人肺腺癌细胞系A549用DMEM高糖 培养液、胎牛血清培养，miRNA一96 inhibitor由上海生工生物公司设计并合 成。 2．细胞转染采用电穿孔转染技术将miRNA-96 inhibitor转入A549细胞内。 实验分组三组：实验组(miRNA一96 inhibitor)，对照组(scramble)，空白 II 摘要 组(blank)。转染后24-一48小时后进行相关实验及指标检测。 3．指标检测采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术检测干扰后细胞内FOX03 mRNA的表达量，采用western blotting技术检测干扰后FOX03蛋白质的表 达量，CCK一8技术检测转染后细胞增殖能力，采用细胞划痕实验检测转染后 细胞迁移能力，采用流式细胞术检测转染后细胞凋亡情况。 4