分子生物学检查7版教程方案.ppt

分子生物学检查 南方医院实验诊断学教研室 温淑娟 §1 基因诊断 §2 流式细胞术及其临床应用 §3 染色体检测 §1 基因诊断 一、基因诊断在实验诊断中的位置 二、基因诊断在临床诊断中的必要性 三、基因诊断的原理、途径 四、基因诊断在临床医学中的应用 临床医学实验诊断技术的发展 细胞形态学技术 (细胞形态和/或数量) 生化检验技术 (生物化学代谢产物和酶) 免疫学诊断技术 (识别特定蛋白质分子的差异) 分子诊断技术 (DNA/RNA和蛋白质) 基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置 转录 翻译 分泌和表达 DNA 核膜mRNA 蛋白 细胞膜功 临床 能性产物 表现 核酸诊断 生化诊断 血清学诊断 临床诊断 （基因诊断） （酶法测定） （血清蛋白） 基因诊断可以更早、更本质地反映生理、病理状况 基因诊断的实验诊断对象 先天遗传性疾患 后天基因突变引起的疾病 外源基因侵入致病 基因诊断的原理 运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达功能是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的途径 基因突变的检测,基因连锁分析,基因表达分析 基因诊断的优点 病因诊断，针对性强；快速；灵敏；特异性高 基因诊断的必要性-----不可替代 基因诊断的常用技术 一、聚合酶链式反应 二、DNA测序 三、核酸分子杂交技术 四、单链构象多态性分析 五、单核苷酸多态性分析 六、连接酶链式反应 七、基因芯片技术 聚合酶链式反应（PCR) PCR？ PCR的原理 PCR的技术特点 反转录PCR 荧光PCR PCR在临床医学中的应用 PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应 是模拟DNA体内 复制过程，在DNA聚 合酶作用下，进行 特定DNA片段的体外 复制。 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、复性 变性、复性 PCR的技术特点 特异性强(几乎没有方法学的假阳性) 灵敏度高 简便快速 对样品要求低 PCR的局限性 RT-PCR(反转录-PCR)（reverse transcription-PCR） 模板选用的是RNA通过逆转录酶聚合而成的cDNA 模板cDNA是一条单链，在反义引物的引导下合成第二链模板DNA，此时才开始常规的PCR扩增 在RT-PCR中，模板量及所抽提的RNA极其重要 可进行一步RT-PCR或两步RT-PCR(巢式或半巢式） 病原体 DNA RNA PCR 裂解抽提 扩 增 产 物 检 测 核酸纯化 PCR检测流程 RT-PCR 凝胶电泳 酶切分析 杂交 核酸序列分析 PCR扩增及产物分析 PCR产物电泳图 p 1 2 3 4 Marker 270 bp Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 荧光共振能量传递（FRET Probe） 双标记探针（Taqman Probe） FQ-PCR反应原理 特异性荧光双标记探针 Taq酶 5’→3’外切酶活性 荧光PCR仪 FQ-PCR实时动力学曲线 FQ-PCR的技术特点 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性 可定量检测，扩展了临床应用空间 光谱技术进一步提高了灵敏度—可检测单拷贝基因 荧光探针杂交，进一步提高了特异性 扩增与自动分析一体化，检测更加简便快速 PCR在临床医学中的应用 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 输血源的筛选 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 核酸分子杂交技术 ?核酸分子杂交？ ?常用的核酸分子杂交技术及应用 常用的核酸分子杂交技术及应用 ? Southern印迹杂交--DNA印迹 ? Northern印迹杂交--研究RNA的方法 ? 斑点杂交--狭缝杂交。DNA、RNA均可检测 ? 原位杂交--检测DN