水产动物疾病学课件第6章(下)水产动物病原检测技术.ppt

第六章(下) 水产动物病原的检测技术 重要内容 第一节 免疫学检测 免疫凝集试验 免疫沉淀试验 与补体相关的试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 一、免疫凝集试验 凝集反应是指颗粒性抗原如细菌、细胞等与相应抗体在电解质存在条件下的结合，出现肉眼可见的凝集现象。细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。 （一）直接凝集试验（direct agglutination） 玻片法 定性多 试管凝集法 定量多 （二）间接凝集试验（indirect agglutination） 将已知可溶性抗原吸附于或耦联于一种与免疫无关的载体表面，形成致敏颗粒，再与相应抗体作用而出现的凝集现象称为间接凝集试验，也称为被动凝集试验。常用于吸附抗原的载体颗粒有动物的红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等。吸附抗原的颗粒称为致敏颗粒。该法十分敏感，可用已知可溶性抗原致敏的载体颗粒检测微量存在的相应抗体。 （三）间接血凝试验（indirect hemagglutination） 间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏载体，再与相应的抗体（或抗原）结合，出现可见的血凝现象，也称为被动血凝试验。 红细胞包被上抗原，用以检测抗体的血凝试验称为正向间接血凝试验（Passive Hemagglutination Test ） 红细胞包被上抗体，用以检测抗原的血凝试验称为反向间接血凝试验（Reverse passive Hemagglutination Test ）。 如果先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，再加入用抗原或抗体致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。 （四）协同凝集试验(Co-agglutination) 金色葡萄球菌细胞壁中的蛋白质成份A（SPA）能与人和多种哺乳动物血清的IgG类抗体的Fc段结合，成为致敏颗粒。特异性IgG的Fc段与SPA结合后，其F(ab’)2段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍保持抗体活性，当与相应的抗原反应时，可借助特异性抗体F(ab’)2段与相应抗原互相连结而呈现凝集现象。在该种凝集反应中，金色葡萄球菌成为IgG的载体，故称协同凝集试验。 二、免疫沉淀试验 沉淀反应是指可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在适当条件下发生结合而出现沉淀的现象。 反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen），可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素（precipitin）。 液相沉淀反应（fluid phase precipitation） 环状沉淀（ring precipitation） 絮状沉淀（flocculation） 免疫浊度测定（immuno-turbidimetry）。 凝胶扩散试验（gel diffusion） 单向琼脂扩散（single diffusion） 双向琼脂扩散（double diffusion） 凝胶免疫电泳（gel immunoelectrophoresis） （一）环状沉淀试验 将已知的抗血清加入到小口径试管的底部，然后将已适当稀释的待检抗原溶液小心地加在抗血清的表面，使两种液体成为分界面清晰的两层。 室温下静置数分钟，若抗原与抗体相对应，则在液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。 本法主要用于抗原的定性试验，如鉴别血迹性质、细菌血清型鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白色沉淀环的最高抗原稀释倍数即为该抗血清的沉淀价。 （二）絮状沉淀试验 可溶性抗原与相应抗血清在试管内或凹玻片上混合，出现肉眼可见的混浊沉淀或絮状沉淀，即为阳性反应。当抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，混浊度最大；当抗原过剩或抗体过剩时，出现后带或前带现象。 通常用固定抗体稀释抗原法（α操作法）或固定抗原稀释抗体法（β操作法），以检测抗原或抗体的最适比例。本法敏感性不高，在疾病诊断上的应用日趋减少。 （三）免疫浊度法 可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。 当反应液中固定抗体或抗原的浓度，在一定线性范围内，反应液的浊度会随着抗原或抗体量的增加而呈正比例增大，与一系列的标准品对照，就可计算出样品中的抗原或抗体的量。 免疫浊度法可分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。 前者需用专门的浊度计，测定的是单纯散射光，后者可用分光光度计（或比色计）和其它自动分析仪，测定的是溶液吸光度。 本法与双向单扩散法有高度的一致性，且敏感性高，操作简单快速，不足之处在于抗血清用量略多于扩散法。 （四）免疫扩散(immunodiffusion) 1、单向琼脂扩