水产动物疾病学课件第6章(上)水产动物病原检测技术.ppt

第六章(上) 水产动物病原检测技术 一、疾病调查和诊断 二、显微镜技术 三、生物化学技术 四、细胞分选技术 一、疾病调查与诊断 1. 调查发病环境和发病史 （1） 调查养殖环境 （2） 调查养殖史和发病史 2. 水质情况调查与分析 （1）水温 （2）pH值 （3）NH3-N （4）溶氧 （5）水的物化性质 3. 了解饲养管理情况 （1）放养品种、来源和密度 （2）喂食情况 （3）注水、施肥、操作等 4. 了解鱼群的异常表现 1. 细菌性疾病的诊断： 病原分离 → 纯化培养 → 人工感染 → 病原种类鉴定 1) 病原分离：准确从病灶部位取材，无菌操作 2) 纯化培养：单菌落纯化培养 3) 感染实验：包括注射感染、浸泡感染和口服感染 4) 种类鉴定：细菌形态、生理生化、16S rDNA测序， 细菌自动鉴定仪 2. 病毒性疾病的诊断： 过程如下： 3. 寄生虫病的诊断 1）取鳃部粘液或者患病组织涂布于载玻片上，光镜或解剖镜下观察描述，有虫子游动即说明有寄生虫感染； 2）运用透射电镜观察患病组织的形态，扫描电镜观察寄生虫的形态特征； 3）测定18S rDNA或ITS序列，生物信息分析确定寄生虫的种类。 4. 真菌病的诊断 1）从病灶部位接种至加有青霉素-链霉素双抗的玉米琼脂平板上培养 2）利用大麻子水培，光镜下连续观察其孢子释放方式，并记录释放时间；设置四个培养温度7℃、15℃、18℃和23℃，连续观察四周或直到有性器官出现，记录其有性器官特征并拍片 3）运用扫描电镜和相差显微镜观察真菌的形态 4）测定其ITS序列，生物信息分析确定其种属 二、显微镜技术 （一）、光镜技术 1、几种常见光学显微镜 A 普通光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；③机械装置，用于固定材料和观察方便。 ※分辨率与放大倍数 分辨率：指显微镜能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： R=0.61λ /N．A． 其中 N．A．＝ｎsinα/2 （n=介质折射率；α=镜口角；N.A.=镜口率； λ＝入射光波长） 放大倍数＝物镜倍数 目镜倍数＝N.A（500－1000） 部分介质的折射率 介质 空气 水 香柏油 α溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66 普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm。 B 暗视野显微镜 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。 C 相差显微镜（PCM） 1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 应用：观察未经染色的标本和活细胞。 一种介壳虫的染色体（PCM照片） D 倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 E 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） F 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） 能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。 尼康E800荧光DIC显微镜 DIC显微镜下的硅藻 G 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） 可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 LCSM照片，蓝色