酶的分离与纯化分析.pptVIP

酶的分离与纯化分析 酶分离纯化的一般原则 酶纯化的基本步骤 酶纯化的常用方法 酶的纯化过程 1、建立一个适当的测活方法 2、酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则 3、酶的提取 4、酶的提纯 5、酶的纯度检验 一、酶的提取 1、生物组织的破碎 （1）机械（匀浆）法 （2）超声波法 （3）冻融法 （4）渗透压法 （5）酶消化法 2、抽提 典型的抽提液由以下几部分组成： 抽提液 = 离子强度调节剂 + pH缓冲剂 + 温度效应剂 (KCl、NaCl、蔗糖) (各种缓冲液) （甘油、二甲基亚砜） + 蛋白酶抑制剂 + 防氧化剂 + 重金属络合剂 +增溶剂 （PMSF、DIFP） (DTT、巯基乙醇) EDTA、柠檬酸 (TritonX-100) 通常都用0.3mol/L的蔗糖溶液或0.15mol/LKCl溶液抽提。 如何開始？ 5W 基本原則 材料來源： 材料取得與保存 均質及抽取： 確實做好第一步 鹽析及沉澱法： 最經濟方便方法 二、酶的提纯 酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用。 常用的提纯方法 酵素的純化過程 可分為三個階段： (1) 粗蛋白質 (crude protein)︰ 採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全蛋白，多使用 鹽析沉澱法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。 (2) 部分純化 (partially purified)︰ 初步的純化，使用各種 管柱層析法。 (3) 均質酵素 (homogeneous)︰ 目標酵素的進一步精製純化，可用 製備式電泳 或 HPLC。 鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質。 蛋白質在水溶液中的 溶解度，會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減，可利用來沉澱蛋白質。 其原理是因於蛋白質分子表面電荷的改變，或者分子上 極性 或 非極性 區域與水分子間作用結果。 ■ 盐浓度對蛋白質溶解度的影響： ● 鹽溶 Salting-in: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中 ● 鹽析 Salting-out: 加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來 設計純化步驟時，需考慮下列各項要求 a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速 組合純化步驟 a. 組合標準 (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行，有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法，組成全部流程。 (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純化，看其結果如何再加改進。 (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化，如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱穩定性等。 近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同 色谱的类型 . 常用的層析方法 膠體過濾法 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球，隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內的固定相，而被延滯流出膠柱 。?分子的 形狀、大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響力。? 膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影響結果的好壞： (1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析力降低甚多。 (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗等。 管柱操作 单击显示 管柱操作的详细步骤 離子交換法 ? 離子交換法 乃利用分子的帶電性質進行分離，解析力好且具多樣性，是重要而應用極廣的純化方法。?? 原理概述　 a. 離子交換法 是一種 adsorption 層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為介質擔体表面的帶電基團。 樣本中各種離子，與介質表面帶電基團間的親和力強弱不同，吸附上去之後，可使用不同離子濃度的緩衝液，分別溶離出這些成分 b. 兩大類離子交換介質 由介質帶電基團的不同，可分為兩大類： 介質-帶電基團 (counter ion) (1) 陽離子交換介質 (cation exchanger)：????? 擔体-陰離子基團 ..... 陽離子? (2) 陰離子交換介質 (anion exchanger)：?????? 擔体-陽離子基團 ..... 陰離子? 色層焦集