动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲详解.pptVIP

Sybr? Green I 是一种dsDNA的内插化学染料，它能够嵌入到双链DNA中并发出强烈荧光。当它没有结合上双链DNA时，只发出相当弱的荧光；当它一旦插入到双链DNA里时，荧光信号就会强烈地增加，并且其荧光强度的增加与dsDNA 的数量成正比。因此可根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物量的增加。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm power sybr green,高灵敏度，可以检测低至2个拷贝数量的靶基因 * * * 探针与模板是特异性结合 ； 5’端标记荧光分子，3’端标记荧光淬灭分子，探针完整的时候，荧光基团发射的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号； 利用Taq酶的5`→3`外切核酸酶活性，在PCR反应进行过程中，切断探针，产生荧光信号，信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 每形成一个DNA双链，就会有相应数量的荧光染料结合 荧光染料与双链DNA一结合，产生荧光信号 荧光信号强度与DNA分子数成正比 * RNA提取及Q-PCR相关技术 主讲：宋志新 利用含有变性剂和Rnase抑制剂的有机溶剂提取RNA，是目前常用的RNA提取方法。 Trizol（主要成分为异硫氰酸胍和酚），具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，保持样品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。样品在Total RNA Extraction Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层?(鲜红色下层)，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可直接用于Northern，点杂交，mRNA纯化，体外翻译，RT-PCR，以及构建cDNA文库等各种分子生物学实验。 Total RNA Extraction Reagent广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物等。 下面介绍动物组织Total RNA的提取方法 RNA提取 RNA 提取 RT-PCR Q-PCR 注意事项总结 概要 RNA提取 概要 RT-PCR Q-PCR 注意事项总结 RNA 提取 实验材料 1、组织（以小鼠肝脏为例） 2、RNAiso Plus（Code No: 9108）（作用同TRIzol） 3、其他：氯仿、异丙醇、75%乙醇、研钵、加样器、1.5ml EP管、枪头等。（均为RNase-free） 0.1%DEPC水 有毒 RNA提取 概要 RT-PCR Q-PCR 注意事项总结 RNA 提取 准备工作 戴口罩、手套、帽子 提取区域：用75%乙醇擦拭试验台 试验器具：用75%乙醇擦拭加样枪 准备RNase-free的枪头和离心管 低温离心机预冷至4℃ 准备-20℃预冷的75%乙醇 RNA提取 概要 RT-PCR Q-PCR 注意事项总结 RNA 提取 RNA的提取步骤 1、从小鼠体内取出肝脏，用预冷的生理盐水清洗。 2、使用液氮迅速冷冻组织， -80℃冰箱保存。 3、使用液氮充分预冷研钵。 4、将称重冷冻的组织（约50-100mg）从冰箱取出后迅速放入预冷好的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成粉末状。（注：无明显的可见颗粒，如果研磨不彻底会影响RNA的收率和质量。） RNA提取 概要 RT-PCR Q-PCR 注意事项总结 RNA 提取 RNA的提取步骤 5、向研磨成粉末状的样品中加入1ml RNAiso Plus，并完全覆盖样品。（注：在加入RNAiso Plus时要保证组织没有融化，否则RNA易被RNase降解。） 6、室温静置5~10 min。 7、待样品融化后，用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转移至1.5ml EP管中，室温静置5 min后，4℃，13000rpm离心5 min，将上清转移至新的1.5ml EP管中。 RNA提取 概要 RT-PCR Q-PCR 注意事项总结 RNA 提取 RNA的提取步骤 8、每1ml液体中加入1/5体积（约200μl）的氯仿，盖紧EP管，用手剧烈震荡15秒，直至溶液充分乳化，无分相现象。（注：不能用振荡器混匀，因为容易造成DNA和RNA的物理降解。） 9、室温静置5 min，4℃，13000rpm离心15 min。 10、从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，上层是透明的水层，RNA溶解在此层中；半固体状的中间层，此层 中包含DNA；下层为粉红色的 有机溶剂，蛋白质、多糖等物 质溶解在此层中。 RNA提取 概要 RT-PCR Q-