基因组测序原理详解.pptxVIP

基因组测序原理 基因组测序原理 第一代测序技术 第二代测序技术 第三代测序技术 第一代测序技术 1、化学降解法 在该方法中, 一个末端被放射性标记的 DN A 片段在 5 组互相独立的化学应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5组放射性标记的分子, 每组混合物中均含有长短不一的 DN A 分子, 其长度取决于该组反应所针对的碱基在原 D NA 片段上的位置。最后, 各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 准确性好，易掌握，但操作麻烦 2、 双脱氧链终止法（Sanger法） 核酸模板在 DNA 聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP , 其中的一种用放射性 P32标记 )存在条件下复制时, 在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) , 因为双脱氧核苷没有3-OH, 所以只要双脱氧核苷掺入链的末端, 该链就停止延长, 若链端掺入单脱氧核苷, 链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后, 分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后, 根据片段 3’ 端的双脱氧核 苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 操作简单，应用广泛。 Sanger 双脱氧末端终止法测序原理 3、荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger原理, 用荧光标记代替同位素标记, 并用成像系统自动检测, 从而大大提高了 D NA 测序的速度和准确性。 4、杂交测序技术 不同于化学降解法和Sanger法, 而是利用 DN A 杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列信息。该方法检测速度快，但误差较大，且不能重复测定。 第二代测序技术（合成测序） 第二代测序流程： 1、454测序技术： 使用的是焦磷酸测序技术。 首先将基因组分割为长度为300 到 500 个碱基对的片段 , 然后将双链解开 , 弃去互补链当中的一条 , 将另一条链与连接在塑料小珠上的复合物结合 , 并使得每个珠子只与一条链发生结合。随后PCR,对结合在小珠上的片段进行复制, 直到各个片段的拷贝完全覆盖其所在的小珠为止。接下来将珠子分散在一个包含大约160 万个小孔的平板 上 , 并加入一系列的测序试剂和核苷酸。每当一个核苷酸被添加到正在延伸的 D N A 链当中时 ,该反应会释放一个焦磷酸 ( PP i ) 分子 ,随即在ATP 硫酸化酶的催化下与腺苷酰硫酸反应生成 AT P , 在位于小孔中的荧光素酶催化下该ATP被用于促进D-虫萤光素发光 。用CCD将每个微球发出光及其强度进行同时成像 , 并将所记录下的发光现象与当时加入的核苷酸相关联 , 可以得到同时发生的几十万个DNA片段的延伸情况。 第二代测序技术原理 2、Solexa测序法： 使用的方法是克隆单分子阵列技术，将待测序的单个基因组 D N A 片段固定在载玻片表面不同的位置上随后 ,对这些单个的 D N A 片段同时进行复制 , 生成大量微小的 D N A 簇 (D N A cluster)。最后 , 在与Sanger测序方法类似的步骤中 , 分别采用 4 种不同颜色荧光基团标记的 4 种核苷酸单体 , 以及标准的微阵列光学检测系统 , 同时检测阵列中那些被固定D N A 链上的引物延伸过程。 Solexa 的测序技术可以同时分析数亿个单个 D N A 单链分子的序列 ,从而能够对个体进行完整的基因分型 3、ABI/SOLID连接酶测序技术： 也被称作为连接测序 (sequenceing byligation) 。在该方法中,DNA片段文库生成以后 ,首先将短的DNA片段固定在微珠上,并通过乳液PCR进行扩增;然后将含有扩增后片段的微珠以阵列的方式排布,再加入测序引物,与固定在每个微珠上的DNA片段中已知的起始序列发生结合。随后,向混合物中加入长度为8个碱基的荧光标记寡核苷酸探针。这些探针从3 ′ 端开始的第5个碱基为查询碱基 , 分别用 4 种不同的荧光标记表示A、G、T 或者C,共分为 4 组。如果一条带有正确互补序列的探针与DNA发生结合,DNA连接酶将把它与测序引物进行连接 , 使得它被固定在表面上,而其他结合得不够牢固的探针分子都会被洗去。接着 ,用激光来激发探针上的荧光标记分