安徽省猪病毒性腹泻病因调查和PEDV分子流行病学研究.pdf

I 摘要 猪病毒性腹泻是由病毒引起的急性消化道传染病，主要病原有猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible gatroenteritis coronavirus，TGEV)，猪轮状病毒(Rotavirus，RV)，猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，猪圆环病毒(Porcine circovirus virus，PCV)，猪伪狂犬病毒 (Porcine pseudprabies virus，PRV)。其流行从 2010 年底开始在我国呈明显的上升趋势， 尤其造成哺乳仔猪大量死亡，给养猪业造成了巨大的损失。其中流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)的危害最为严重，该病毒以损坏猪小肠为主，引起猪水样腹 泻和严重脱水为主要临床症状，已成为降低猪出栏率的重要原因之一。本文对安徽省 部分地区猪场的猪腹泻主要病毒性病原进行了流行病学调查和对 PEDV 的 M、N、 ORF3 基因的遗传进化进行了研究，研究内容如下： (1)本研究对 2010-2013 年安徽省 14 个县市的 23 个发生猪腹泻的猪场采集了 138 份肛拭子、肠道及内容物，利用(RT-)PCR 方法对病料中 7 种主要病毒性腹泻病原进 行了检测：CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、RV、PRV、PCV2 等 7 种。检测结果显 示，PED 阳性猪场有 19 个，阳性率为 82.6%，PED 阳性病料 81 份，PEDV 阳性率高 达 58.7%。其中 CSFV、PRRSV、TGEV、RV、PRV、PCV2 的阳性检出率分别为 2.9%、 1.44%、2.17%、1.44%、4.35%、7.25%。多个猪场出现 PEDV 与其它病毒的混合感染， 其中与 PCV2 的混合感染最为严重，混感率为 6%。混合感染在猪腹泻病中广泛存在， 圆环病毒由于其免疫抑制作用，出现更严重的临床症状。 (2)为了探讨安徽省流行的 PEDV 遗传变异情况，本研究对 19 个 PED 阳性猪场 的病料进行了 PEDV 的遗传变异相关基因 M 和 N 及毒力基因 ORF3 的扩增及遗传变 异分析，以弄清安徽省 PEDV 分子流行情况，为安徽省 PED 防控提供理论基础。本 研究参照 Genbank 中 PEDV 序列，设计 4 对特异性引物对 PED 阳性的 19 个猪场的阳 性病料分别进行 M、N 和 ORF3 基因的扩增，扩增获得的片段经切胶回收后连接 pMD18-T 载体，挑取阳性克隆并测序，并用 DNASTAR 和 MEGA5.0 等软件将目的 基因进行同源性的比较和遗传进化分析。所扩增的目的基因片段均有完整的开放阅读 框，M 基因大小为 681bp，N 基因为 1326bp，ORF3 基因为 675bp。M 基因同源性分 析表明，安徽地区 PEDV 流行毒株 M 基因之间同源性为 98.3%-100%，与欧洲毒株 (CV777；Br1/7)同源性为 97.4%-98.2%，与日本毒株(83p-5)的同源性为 97.4%-98.4%， 与韩国毒株(DR13；CPF531；PFF1051)同源性为 97.1%-98.2%，与我国其它省份：北 京株(BJ2010)、广东株(GDYD)、江苏株(JS200402)、福建株(FJPT2011)、山东株(SDM) 同源性为 96.8%-100%，与美国毒株(USAIow164652013；USAIndiana178462013)同源 万方数据 II 性为 99.1%-100%。M 基因较保守，各毒株之间差异不大，为针对 M 蛋白的基因工程 疫苗的开发奠定了基础。2012-2013 年安徽地区毒株 M 基因与美国株同源性最高，尤 其 2012 年的 AHFY、AHLA、AHLX、2013AHFD、2013AHMAS，2013AHLX 株的 M 基因与 2013 年报道的美国株(USAIndiana178462013)的同源性达到 100%，表明基 于 M 基因分析，PEDV 的流行不具有地域性。基于 N 基因的同源性分析表明安徽地 区毒株之间 N 基因同源性为 95.9%-99.9%，与欧洲毒株(CV777；Br1/7)的同源性为 94.1%-95.9%，与日本毒株(83p-5)同源性为 94.7%-97%，与韩国毒株(DR13；Chinju99) 同源性为 92.8%-97.1%，与美国毒株(USAIow164652013；USAIndiana178462013)同源 性 为 97.3%-99.8% ， 与 我 国 其 他 省 份 ：