第8章DNA重组.pptVIP

重组DNA技术 DNA Recombination Technique 基因克隆的原理 核酸的提取和检测 核酸的分子杂交 PCR技术 基因文库的构建 基因表达 重组DNA技术的原理 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件 目的基因的克隆 基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 核酸的提取及检测 就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 基因组DNA的分离与纯化 DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染 一般步骤 (1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶 (2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA cDNA的分离与纯化 （1）mRNA 分离 RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源 外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍 Trizol试剂 （2）The first strand synthesis （3）The second strand synthesis cDNA第二链的合成方法－置换合成法 利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。 从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。 cDNA第二链的合成方法－置换合成法 质粒DNA的分离与纯化 质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位 共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的分离 质粒DNA－碱裂解法原理 核酸的检测 包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法 dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染（why?） 凝胶电泳法 凝胶电泳技术 样品的物理性质 分子大小、电荷、空间构型 支持物介质 琼脂糖，100-60000bp, 聚丙烯酰胺，1-500bp 电场强度，5V/cm 缓冲液离子强度 TAE, TBE, TPE 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小(bp) Agarose 0.3 50000~1000 0.7 20000~1000 1.4 6000~300 PAG 4.0 1000~100 10.0 500~25 20.0 50~1 指示剂 溴酚蓝，二甲苯青 终止酶反应 便于加样 监视实验进行 染色剂 溴化乙锭EB 吖