RNA 提取细节-赞.docxVIP

内容来自网络，主要是dxy另外，提示下下，TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。其实酚有水饱和酚和tris饱和酚，它们的pH值是不同的。前者pH值7，用于RNA的提取，后者pH值7，用于DNA的提取。楼主注意一下苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来我这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern是足够的了,和广大战友分享下多酚类植物的RNA提取○1?1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min.○24度12000rpm离心15min, 上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次○3取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.○412000rpm离心10min○5沉淀用70度乙醇洗○68000rpm 5min○7沉淀晾干,溶于30ulDEPC水附提取buffer 200mlNaCl 1.1688g 100mMTris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0)?EDTA 5.8450g 10mM?SDS 2.0000g 1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。（320差不多也就是那条曲线刚下降到0的时候）。所以，当我们检测260/280后，如果比值在1.8-2.0之间时，我们可以说其纯度可以，那OD260的值就有效。否则，OD260的值判为无在论坛里混了很长时间，得到了很多帮助，特别是 上海孤儿 的无私奉献更让我感动。所以决定办一个RNA抽提细节的系列交流。为什么只谈细节呢？因为原理书上都有。当然这个系列主要是针对刚涉及RNA抽提的新手，老手免看，^_^。今天是第一讲：RNase真的很顽固吗？刚涉及RNA抽提的新手都会听到别人说RNase很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。于是在配制tris缓冲液时就遇到了两难的境地。tris缓冲液不能用DEPC处理，只能用DEPC处理过的水配制，那么在药品称量、调pH值等过程中tris缓冲液会造到RNase的再次污染，所以是一个两难的境地。但是今天我要谈的是RNase并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。下面的实验照片（照片来自ambion）很清楚的显示了高压灭菌的效果。实验很简单，将不同含量的RNase用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的RNase一起来降解RNA（37度1小时），结果表明，当RNase的污染量小于100ng/ml时，高压灭菌可以去除其活性。这张照片还说明了一个问题，当你的RNA溶液中含有很微量的RNase污染时，不用过于担心，因为RNase对RNA的降解是需要时间的，更何况你的RNA是存放在低温下的。讲得不好，请大家拍砖，但不要打脸哦，^_^?javascript:void(0)0DEPC有致癌性，不能处理Tris溶液等这些事项大家都知道，所以不谈。谈一些实验室中的操作误区。误区一：重复使用含DEPC的水处理枪头、离心管等。由于DEPC较贵，而且书上说DEPC要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用DEPC的想法，即对含有DEPC的水不进行高压灭菌，从而重复使用含DEPC的水处理枪头、离心管等。节约本是好事，但这样的节约是无效的。为什么不能重复使用含DEPC的水，因为DEPC在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC在pH6.0和pH7.0的PBS缓冲液中的半衰期分别约为20min和10min，DEPC在水中的半衰期约为30min。因此，重复使用含DEPC的水就不能保证枪头和离心管的RNase-free。误区二：必需长时间高压灭菌来彻底去除DEPC。用DEPC处理过的溶液，在15－20min的高压灭菌后还可以闻到一股特殊的香味，因此有人认为高压灭菌去除DEPC不彻底，所以要延长高压灭菌的时间以完全去除DEPC。但是延长高压灭菌的时间并不需要，因为闻到的特殊香味不是DEPC的，而是DEPC分解产物之一的乙醇同溶液中残留的微量的羧酸（如甲酸和乙酸等）反应产生的挥发性脂类。这种特殊的水果香味不代表有痕量的DEPC残留。误区三：溶液中DEPC含量约高，灭活RNase的效果越好。这个误区错了一半，的确，1% DEPC能灭活高达1000 ng/ml的RNase A，而0.1% DEPC只能灭活少于500 ng/ml的RNase A。但是溶液中残留的DEPC副产物会抑制一些酶