食品专业生化四个实验.docVIP

实验一 凯氏(Micro—Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量 一、实验目的 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。 二、实验原理 常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而有机氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。 但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，加快有机物分解，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行，还具有作为消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。甘氨酸的消化过程可表示如下： 消化：CH2NH2C00H + 3H2S02 — 2C02+ 3S02+ 4H20 + NH3 2NH3+H2S04 一 (NH4)2SO4 蒸馏：(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +NaSO4 + 2NH3 吸收：2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H20 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H20 2 NH4Cl + 4H3BO3 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。 三、器材 1．50 mL消化管或100 2．凯氏定氮蒸馏装置或改 mL凯氏烧瓶 进型凯氏定氮仪 3．50 mL容量瓶 4．3 mL微量滴定管 5．分析天甲 6．烘箱 7．电炉 8．1 000 mL蒸馏烧瓶 9．小玻璃珠 10．远红外消煮炉 1．消化液(过氧化氢：浓硫酸：水=3：2：1) 200mL 2．粉末硫酸钾一硫酸铜混合物 16g K2SO4与CuS04.5H20以3：1配比研磨混合。 3．30％氢氧化钠溶液 1000mL 4．2％硼酸溶液 500mL 5．标准盐酸溶液(约0．01 mol／L) 600mL 6．混合指示剂(田氏指示剂) 50mL 由50mL 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0．1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 7．市售标准面粉和富强粉各2g 1．凯氏定氮仪的构造和安装 凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应管及冷凝器3部分组成。蒸汽发生器包括电炉及一个1-2L（升）容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个玻璃杯，其上端通过反应室外层与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应室外层下端有一开口，上有一皮管夹，由此可放出冷凝水及反应废液。反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中，反应管及冷凝器之间借磨口连接起来，防止漏气。安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接与冷凝器相连，根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意，否则容易引起氨的散失及反应室上端弯管折断。然后将蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。 2．样品处理 某一固体样品中的含氮量是用lOOg该物质(于重)中所含氮的g数来表示(％)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。 在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取O 1 g左右的干燥面粉作为本实验的样品。 3．消化 取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各加1颗玻璃珠，在l及2号瓶中各加样品0.1.g，催化剂(K2S04一CuS04·5HO)200 mg，消化液5 mL。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放