第六章 加压液相柱色谱.pptVIP

第六章 加压液相柱色谱分离制备技术 根据制备型分离中所用压力的大小，可分为列几种色谱方法： 一、快速色谱 约2bar/30psi 二、低压液相色谱 5bar/75psi 三、中压液相色谱 5-20bar/75-300psi 四、高压液相色谱 20bar/300psi (1 bar ＝ 105Pa = 100kPa = 760mmHg) 低、中、高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叉，只是为了区分方便，才如此划分。 第一节 快速柱层析 （FCC法）（Flash Column Chromatography ） 应用普通柱分离法解决了所制备化合物不能用重结晶、分馏、蒸馏等方法分离纯化的问题。 然而传统的柱分离往往是非常耗时，当样品1g or 2g，一天、两天、一星期是经常的。同时伴随着t增长， ①造成拖尾现象而收率降低； ②敏感的化合物易分解。 FCC特点 快速柱层析（FCC）可克服普通柱分离的缺陷，它具有快速省时、分离效率高、简单易行的优点，所以国内外实验室基本都倾向于用此法。 对于0.01-10g的样品，Rf值0.15的情况下，在10-15分钟可快速得到分离。 该法首先由still于1978年详细介绍，1981年获专利保护。 一、层析条件 1、吸附剂硅胶：选用60埃，粒度为40-63um (230-400目)。过大、过小都会使分离度减少。分离度通常用保留时间r对半峰宽w/2的比值表示。 由实验获得硅胶颗粒大小与分离度以及峰宽w(w/v)相关的关系图。 由图可知，在给定的标准条件下，常用硅胶60（70－230 mesh, 63-200um）表现出最差的分辨率， 而硅胶60 （40－63um）的固定相可得到最好的分辨率。 2、流动相 A 、通常以TLC层析条件为依据，对被分离成分 ，要求Rf值在0.35左右 B、选择在TLC板上对混合成分有良好的分离。要求△Rf0.15 △Rf值=0.1时，上样量小时也能分离。 C、流速：由实验证实，使用硅胶60 （40－63um）作为固定相，流速为2in/min时，可得到最好的分辨率 3、干法装柱： 硅胶高度5-6in≈15cm左右，装柱法与普通法相同。 溶剂加入后，加压，排除空气，并使硅胶溶剂化。 4、上样、洗脱与收集 采用40-63um硅胶为吸附剂时，柱的大小、硅较用量、加样量、每次收集的体积见表 5、压力泵 一般要求0.4-0.3Kg/cm2 即可。 约2bar/30psi.(每平方英吋磅)， 可通过控制流速 2in/min 来实现。与层析柱上端相接的塞子是一个压力控制伐，可调节压力而调节流速 如图所示。 二、小结 快速柱色谱的条件与步骤： （1）选用对欲分离成分在TLC板上有较好的分离效能的洗脱剂，Rf值＝0.35；△Rf0.15 （2）选择合适的层析柱，内装粒度40-63um（230-400目）的硅胶，高度5－6inch， （3）加入洗脱剂，在压力下快速将硅胶中空气排除。 （4）上样后，加洗脱剂洗脱，控制(压力)流速2.0in/min （约5cm/min）， 以上是快速柱色谱的必要条件 （The crucial for successful separation by this method） （5）一般的样品在15min即可分离出。 三、实验示例 对于光学异构体1和2的分离，选择5％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，Rf值分别为0.35和0.24，△Rf＝0.09，1g的1与2的混合物，用直径的40mm层析柱，65ml为一个流分，在7分钟内，可迅速分离。洗脱剂总体积为500ml. 四、其他快速层析 1、快速干柱色谱 2、反向快速干柱色谱 （化学键合相填充柱） 第二节 低压液相色谱（LPLC )――液相层析预制柱法 本法是用直径、高度不同的玻璃柱，二端制成螺纹接口。内装粒度较小填充剂，配成一定机械附件，用含氟塑料细管相连，使操作半自动化。 它不需要HPLC那样的高精密度输液泵( 5bar/75psi )，却具有HPLC的某些优点，层析柱可反复应用，可根据被分离物的不同，制备不同规格层析柱，包括反向层析的填料，分离效果高于一般的柱层析。 上样量高于HPLC，无须特别设备，实用省时，易于普及等优点。Lobar柱可分离g数量级样品，其分辨效果有时可接近HPLC分辨率。 除了自制的色谱柱外，使用最广泛的制备型低压液相色谱系统是Lobar系列产品（MERK公司），其中包括多种规格的预制柱（商品化）。 由于色谱柱是由玻璃制成，所以可看到其中的填料。 色谱柱两端被烧结的玻璃所封闭，色谱柱两端联有聚四氟乙烯环的金属管,分别与输液泵和接受器相联。 各种规格的色谱柱的尺寸及