药物化学第2章糖和苷分析.ppt

* ——Feling试剂不能过量，否则产生的沉淀会重新溶解。得到沉淀后用水洗涤，然后用5% HCl(V/V)的乙醇液分解此络合物，用乙醇洗去CuCl2，得多糖。 氢氧化钡络合法 饱和Ba(OH)2溶液 ——当Ba(OH)2浓度小于0.03mol/L时葡甘露聚糖和半甘露聚糖可全部沉淀，但阿拉伯聚糖和半乳聚糖不沉淀。沉淀用醋酸(2 mol/L)分解，上清液加乙醇沉淀即得游离多糖。 * （四）有机盐沉淀法： 2000年美国专利(US75920000111)报导从植物与微生物中提取粘多糖或蛋白多糖的新方法： ——溶液中加入有机酸单宁，与多糖形成有机盐复合物而沉淀。离心得沉淀，沉淀用有机溶剂或其它物质使单宁除去 目前这种方法已用于制备多糖药物、化妆品、保健品中。这种方法特别适合于从芦荟及葡聚糖中分离乙酰化甘露聚糖。 * （五）、季胺盐沉淀法： 长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物，在低离子强度的水溶液中不溶解的特性，使其沉淀析出，然后增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐离解，最终溶解。 ——常用于分离酸性多糖及中性多糖。季胺盐有十六烷基三甲基胺盐的溴化物(CTAB)及其碱（CTAB—OH）和十六烷基氯化吡啶（CPC）。实验时除控制溶液的离子强度外,还必须控制溶液的pH值. 季胺盐沉淀法是一种较经典的方法，至今在多糖的纯化中还在使用，如香菇多糖的纯化，日本就是用此方法。 * （六）、柱层析方法： ——使用最多的方法，效果好，操作简单 （1） 纤维素柱层析： ——乙醇液将柱内纤维素（载体）平衡 ——多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素 ——不同浓度乙醇水溶液（如80%、60%、40%、20%）洗脱 ——不同多糖依次洗脱出来 先洗脱的是分子量最小的多糖 最终洗脱的是分子量最大的多糖 * 在洗脱过程中，由于各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离开来。 实质上与分步沉淀法相反——分步溶解法——其理论塔板数较高，流出液的纯度高 ——缺点是流速慢，纯化周期长，特别是对于粘度较大的酸性多糖 * 装柱与通常装柱法不同 ——32g硅藻土与500ml 0.2mol/L CaCl2溶液相混，在搅拌下逐步加入640ml 0.2mol/L K2HPO4溶液，得到均匀散布于硅藻土颗粒中的磷酸钙沉淀，然后将此悬浮液装柱，上样后用0--0.2mol/L不同离子强度的磷酸缓冲液（pH6.5）洗脱。 这种柱的流速也不快，所以柱层析一般在冷房中进行，以防止样品发霉变质。 分离酸性多糖采用的载体为硅藻土与磷酸钙的混合物： * （2）阴离子交换柱层析： ——纯化中首先使用的方法 ——柱层析中应用的最普遍的一种方法，特别是对于体积较大的多糖溶液，大多数首先采用阴离子交换柱层析。 通过层析多糖溶液得到浓缩及初步纯化（有的多糖通过该步骤即可得到各种均一多糖组分）。 ——至今应用最广泛的阴离子交换剂 二甲氧基乙基纤维素(DEAE—cellulose) DEAE—葡聚糖(DEAE—Sephadex) DEAE—琼脂糖(DEAE—Sepharose) * DEAE—cellulose应用得最广泛 ——DEAE—cellulose具有开放性的骨架，多糖能自由进入载体中并进行迅速扩散 ——较大的表面积，虽然其离子交换容量仅为0.70—0.75mmol/g，但其对多糖的吸附量较离子交换树脂大许多 ——纤维素上的离子交换基团较少，排列疏散且碱性弱，对大分子的吸附较弱，用一定离子浓度的盐就可将其洗脱下来 * 阴离子交换柱层析 ——适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖 分离机理不是单一的离子交换，更重要的是吸附与解吸附——不同结构的多糖在阴离子交换剂上的吸附力强弱是不同的——应用于中性多糖与酸性多糖的分离，不同中性多糖的分离。 一般在pH6时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，然后用pH相同离子强度不同的缓冲液将酸性多糖分别洗脱下来 柱为碱性（即OH型）时中性多糖也能吸附 * 多糖在交换剂上的吸附力与多糖结构有关 ——吸附力一般随多糖分子中酸性基团的增加而增加 ——对于线状分子，分子量大的中性多糖较分子量小的易吸附 ——对于直链多糖与支链多糖，则前者吸附力大于后者 100gDEAE—纤维素可上样多糖0.5-1.5g 洗脱方式通常是不同离子强度的缓冲液 梯度式洗脱/阶梯式洗脱（又称分段洗脱） * ——中性多糖还能与硼砂形成络合物 将DEAE—纤维素处理成硼砂型，使多糖溶液通过，则多糖与硼砂络合吸附于柱上，然后用不同浓度的硼砂盐溶液进行洗脱 首先流出来的是不与硼砂络合的多糖 最后流出的是与硼砂络合力最强的多糖。 * ——DEAE—纤维素可反复使用 一般新的或用过的DEAE-纤维素是如此处理的： 将其悬浮于大体积的水中，让其自然沉降，倾倒法除去细颗粒，用0.5mol/LN