生化大实验实验步骤分析.docVIP

实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测 实验目的与原理简介 质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等）。④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。 分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。 提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 二．实验试剂 1，SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%葡萄