经典色谱法液相导论.ppt

第10章 经典液相色谱法 液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。 第1节 液-固吸附柱色谱 （一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）色谱条件的选择 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心， 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附 能力差异而实现分离 碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 如：生物碱 中性氧化铝 pH 7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 如：生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸碱中不稳定的苷类、酯、内酯等化合物 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质 如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质 （三）色谱条件的选择： 1. 被测组分性质（极性大小）： 烷烃＜烯烃＜醚 硝基化合物 二甲胺＜酯＜酮＜醛 胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸 2. 吸附剂的选择： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 “相似相溶”原则 ：分离极性大的物质应选用极性大的溶剂作流动相，分离极性小的物质应选用极性小的溶剂作流动相， 4. 三者关系图示： 1、Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关 2、色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为 3. 相对比移值Rs 讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1 （三）操作方法： 制板 点样 展开 检视 硅胶薄层色谱法 （一）制板 粘合剂：水或CMC-Na，用量1:3 厚度：0.3mm，制备时0.5mm 活化：自然晾干后，105℃烘1h 贮备：干燥器 （1）样品溶液的制备： 一般用低沸点、弱极性、易挥发的有机溶剂。不宜用水。 （2）器具：毛细管、微量注射器 2、点样 （3）点样量：1~10μl （4）点样方法：垂直方向，不能用力太大 （5）点样后溶剂须挥干 点 样 1cm 1cm 点样斑点直径≤2mm 一般为圆点，或条带状 展开槽（层析缸） 要求：密封性好 3、展 开 单槽 双槽 展距：8~15cm 1、展开方式 上行法展开、近水平展开方式 对展开剂的基本要求： ? 不与组分或吸附剂存在化学反应 ? 使样品各组分分离，分离度 1.5 ? 使待测组分的Rf在0.3~0.5 ? 展开后各斑点圆而集中，不拖尾 ? 具有适中的沸点和小的粘度 ? 临用前配制 2、展开剂 展开剂的组成：单一溶剂、多元溶剂 单一溶剂：重现性好，分离能力差 多元展开剂：可改善分离效果，重现性差 展开系统的优化 优化原则：先调整展开剂极性使待测组分Rf值适中，保持这个极性不变，改变展开剂的选择性，直至所有组分有合适的分离度 Stahl图解法 展开剂 极性 非极性 V 活性I 吸附剂 待测物 非极性 极性 展开系统的优化 Rf值的决定因素：①组分极性 ②展开剂的极性 ③吸附剂的活性 ? 加入少量的酸碱 常用酸：甲酸、冰醋酸 常用碱：浓氨水、乙二胺 展开系统的优化 ? 展开剂用量： 展开剂浸没薄板下端约0.5cm 常用展开系统 人参皂苷、黄芪甲苷： 氯仿-甲醇-水（65：35：10，下层） 正丁醇-醋酸乙酯-水（4：1：5，上层） 黄酮苷：醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1） 糖：正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5，上层） 展开系统的优化 中等极性：甲苯-醋酸乙酯-甲酸（10：3：0.5 苯—醋酸乙酯—甲醇—异丙醇—浓氨水（6：3：1.5：1.5：0.5） 展开系统的优化 3、展开过程的控制 （1）展开方式：多次、分步展开 AB A B 一次展开 多次展开 原因：低极性低沸点物质在薄层板边缘易挥发 ①产生边缘效应 克服办法： a “预饱和” b 层析缸内壁贴浸湿的滤纸条 c 点样时不要太靠边缘 展开过程的控制 （2）溶剂蒸气的饱和程度 * * * * 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短 固定相为固体吸附剂，属吸附色谱 （一）分离原理 （二）、吸附剂 对吸附剂的要求： （1）具有较大的表面积和一定的吸附能力 （2）颗粒要有一定的细度 d 75-150μm，即 100-200目 ，且粒度均匀 （3）与洗脱剂及样品不起反应 常用：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔树脂 吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键 适用范围：微酸性（pH 4~5）， 适于酸性和中性物质 失活：水与硅醇基结合使其失去活性 活化：105-110℃加热30min 粒度：100-200目