RNA干扰抑制RANKL基因治疗大鼠局部骨质疏松的实验研究.docVIP

RNA干扰抑制RANKL基因治疗大鼠局部骨质疏松的实验研究 摘要：目的：观察体外筛选出的带有siRNA片段的具有高效抑制RNAKL表达的慢病毒颗粒对大鼠局部骨质疏松是否具有治疗作用。方法： 将健康雌性SD大鼠40只随机分为4组，分别为（+）病毒治疗组、（-）病毒对照组，生理盐水对照组和空白组，每组10只，空白组为假手术组。进行局部骨质疏松造模，13周后开始给药，给药12周后，处死测血清指标血钙（Ca）、血磷（P）、碱性磷酸酶（ALP），双侧股骨近端骨密度。结论：通过慢病毒载体介导RNA干扰抑制大鼠RANKL基因的表达是成功的。RNAi技术可成功的对骨质疏松大鼠大鼠起到治疗作用。 关键词：RNA干扰技术;RANKL基因;骨质疏松; 骨质疏松（ Osteoporosis，OP） 是一种全身性骨量减少、骨组织微细结构被破坏、骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。它与机体的骨重建失衡有关，破骨细胞的骨吸收的速度超过骨质形成速度导致骨质疏松[1]。本研究即采用带有目的基因的慢病毒颗粒进行局部注射治疗，通过对血清指标、骨密度检测，验证其是否具有抑制局部破骨细胞的破骨作用，为临床治疗骨质疏松症奠定实验基础。 1、 材料和方法 1.1实验动物及仪器 将成年的、雌的SD大鼠40只（内蒙古大学动物实验中心），体重在100g左右， 分为4组：（+）病毒治疗组、（-）病毒对照组，生理盐水对照组和空白组，每组10只，空白组为假手术组。双能X线骨密度仪：美国HOLOGIC公司。全自动生化仪（日本东芝）。 1.2慢病毒载体的构建 由试剂公司根据已知RANKL基因序列按siRNA序列原则包装慢病毒载体。（+）慢病毒所携带的基因序列：5’→3’GCG CAG AUG GAU CCU AAC AdTdT（-）慢病毒所携带的基因序列：5’一3’UUC Ucc GAA CGU GUC ACG UTT，并且在体外已证实具有沉默RANKL基因的作用[2]。 1.3造模及治疗 大鼠用10%的水合氯醛以3ml/100g行腹腔注射，麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于事先制作的老鼠手术台上，于腹股沟正中处做纵切口，长约2cm，切开皮肤及皮下筋膜，水平切断左侧股神经，靠近上段予以切除5mm，并作神经断端打结，缝合切口。再将大鼠取俯卧位固定于手术台上，在股骨大转子与靠近尾部之间与后外方45°方向行长约1cm的切口，暴露坐骨神经，靠近近端予以切除5mm，并作神经断端打结，缝合切口。普通喂养13周后给药[3]。 1.4标本获取 治疗12周后，麻醉大鼠，先采用双能X线骨密度仪测双侧股骨骨密度。再用心脏体外采血法对每只大鼠采血3mL，离心，测血清Ca、血P、ALP，记录数值。 1.5统计学方法：以上实验结果数据应用数据SPSS 19.0统计软件分析，结果以均数±标准差（X±S）的形式表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，，Plt;0.05为差异具有统计学意义。 2、 结果 2.1血清Ca、P、ALP的测定结果 各组血清Ca、P、ALP检测值均在正常范围，血清Ca、P组间比较差异无统计学意义（Pgt;0.05），同组实验前后比较差异无统计学意义（Pgt;0.05）;血ALP在（+）病毒治疗组，（-）病毒对照组，生理盐水对照组组间比较有明显统计学意义（Plt;0.05）。 2.2BMD的测定 （+）病毒治疗组与（-）病毒对照组，生理盐水对照组、空白对照组比较有明显统计学意义（Plt;0.05），其他三组比较无统计学意义（Pgt;0.05）。 3讨论 骨质疏松和其引起的脆性骨折，已经成为了危及人类健康及平均寿命的主要疾病之一。RANKL/RANK/OPG系统是骨质疏松发生机制中研究最为广泛的。RANKL/RANK/OPG轴作用机制如下：各种骨吸收的刺激因子通过3条信号传导途径诱导成骨/基质细胞膜上表达RANKL分子。RANKL通过与破骨细胞前体细胞膜上RANK直接结合，将信号传入前体细胞，刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞，发挥骨吸收功能。OPG竞争性与RANKL结合，从而阻断骨吸收信号的传递抑制破骨细胞分化、成熟。RNA干扰技术是指一些小的双链 RNA（dsRNA）在细胞内 Dicer 内切酶的识别、结合、酶切下，产生有活性的长度为 21～23nt 干扰性 RNA（siRNA），与互补的目的基因的 mRNA结合并使之降解，从而达到抑制目的基因表达的作用。高坤等[2]在细胞水平研究发现RNA干扰沉默RANKL表达可下调成骨细胞RANKL/OPG 比值，抑制破骨细胞的生成。在此基础上本试验将此技术应用到动物活体实验中，进一步证实RNAi沉默RANKL基因是成功的。 本实验通过RNAi诱导与其同源的mRNA降解这一原理，设计慢病毒介导的携带RANKL的载体，实验起初制作大鼠局部骨质疏