中华稻蝗染色体C带核型特征分析.pptVIP

中华稻蝗染色体C带核型特征分析 一 、目的与要求 1、了解染色体常规核型和染色体C-带核型的概念。 2 、掌握染色体C-带显色技术。 二 、原理 染色体是遗传物质的载体，如果染色体发生变化了，生物的外在性状必然发生变化。染色体数目的变化比较容易察觉，但是染色体结构和组成成分的变化就比较难以发现。染色体显带技术使不可察觉的染色体结构和成分变化转变为可以定量表述的带型变化，染色体带型结构的研究大大推动了昆虫细胞分类学的研究和发展。 染色体分带技术：染色体经物理、化学因素处理后，再进行染色，使其呈现特定的深浅不同带纹（band）的方法。 染色体分带技术可分为两大类，一类是产生的染色带分布在整个染色体和长度上，如Q、G和R带；另一类是局部性的显带，它只能使少数特定的带或结构染色，如C、T和N带等。其中C-带主要显示着丝粒附近的异染色质，故称为C-带。其他异染色质均可显示。染色体标本经一定浓度的酸（HCl）和碱[Ba(OH)2]处理后，在缓冲盐溶液（2×SSC）中温育1小时，再以Giemsa染液染色即可显带[1]。 染色体C-带核型包括染色体C-带结构特征、C-带位置、染色强度，异染色质含量等。 而染色体常规核型是指有丝分裂中期染色体特征的总和，包括染色体的数目、大小和形态特征等方面。 作为细胞分类学指标，染色体C-带核型可以从不同层次上反映其生物类群间的分类关系。染色体C-带在同一属内有一明显而恒定的C-带结构模式，往往构成“标志性C-带带纹”，由此可以进行属级分类单元的比较。例如，所研究过稻蝗属物种的L2染色体除都具有着丝粒C-带而外，每个具体物种还具有各自标志性的染色体C-带带纹，但不同物种间该染色体的标志性带纹位置多变，其中，中华稻蝗该染色体具有端带，小稻蝗该染色体具有近着丝粒居间带，山稻蝗该染色体具有亚中部居间带，而日本稻蝗该染色体兼具有亚端部居间带和端带。因此C-带核型分析可为蝗虫分类提供细胞学依据。 三、实验用品 1、仪器 解剖镜、OLYMPUS 光学显微镜、冰箱、液氮罐、恒温水浴锅、离心机等。 2 、用具 载玻片、盖玻片、培养皿、解剖针、眼科镊子、剪刀、微量进样器、以及药品配制和存放所需要的一系列玻璃器皿。 3 、供试药品 0.05%秋水仙素、低渗液（0.075M氯化钾）甲醇、冰醋酸、酒精（70%）卡宝品红染液、盐酸（0.2N）、氢氧化钡（5%）、柠檬酸钠、氯化钠（2×SSC）、吉姆萨染液。 四、实验方法 1、预处理 将野外采集到的蝗虫雄性个体注射0.05%的秋水仙素溶液（3-8ul，视个体的大小而定），此步骤可提供较多的中期细胞分裂相。7小时后，将活的虫体腹部侧处（2-4节体腔内背板侧下方）剪一小口，用尖头镊子夹出精巢（保留虫体，以备鉴定），然后放入低渗液10分钟后，转入卡诺固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），24小时之后再换固定液，换至精巢发白为止。最后移至70%酒精中保存备用。若标本需长期保存，应放入4℃冰箱中。 2、染色体制片 （1）压片法 用镊子夹取精巢的精小管，置于载玻片上，在解剖镜下剔去表面的结缔组织，并切去末端膨大部分（约是精小管1/4-1/3处），此过程进行时应随时滴加固定液以防止蒸发干燥，将取好的3-5个精小管末端放到预先滴上1-2滴40%-60%的冰醋酸溶液的载玻片上，加盖片软化15分钟，然后施加压力，使细胞分散（在压片过程中应注意大拇指翘起垂直加压）。将压片置液氮罐中快速冷冻后，用刀片揭去盖玻片，在室温无尘处自然干燥（或放入恒温干燥箱），经老化3-8天后进行后续分带处理。对于常规核型观察，制片可直接用品红染色后观察[2, 3]。 （2）滴片法 从经预处理的雄性蝗虫体内取出精巢，经低渗处理，并置生理盐水中剔出脂肪等附着物，切取精小管端部，置于研钵中进行研磨。待研成匀浆后，倒入离心管中用500转/分的转速离心后去沉淀，或可用尼龙砂箔进行过滤，然后，以1000转/分离心10分钟，去上清，滴加固定液吹打均匀，再行离心1-2次使充分固定，最后加入适当固定液吹打均匀，取出冰箱内预冷的洁净载玻片，滴加细胞悬液1-2滴，过火焰干燥，或室温下自然干燥，老化2-3天后，进行后续分带处理。新鲜材料可采用此法。 （3）涂片法 将精小管末端部置于预冷洁净的载玻片上，滴加一滴固定液后，迅速用尖头镊子将材料夹碎弃除大块状物，再加一滴固定液，吹散细胞，过火焰干燥，老化后，进行分带处理。注意用新鲜材料效果较好。 以上制片方法除用于精巢材料外，对于胃盲囊、卵巢等组织也同样适用。 3、 C带显带步骤： （1）饱和Ba(OH)2处