松江湿地沉积物细菌T―RFLP分析中PCR体系的建立与优化.docVIP

松江湿地沉积物细菌T―RFLP分析中PCR体系的建立与优化 　　松江湿地为松花江河漫滩地，地势平缓，依托松花江呈东西向带状分布，包括松花江滩涂湿地和支流河口湿地在内的广阔湿地资源，是全国面积最大的原生态城市湿地。湿地内植物区系组成多样，生物多样性丰富，是黑龙江省哈尔滨市重点保护、开发、建设的生态文明区，也是近年来较重视的生态研究区。微生物是湿地生态系统的重要组成部分，在湿地养分的生物地球化学循环中往往起着核心作用，湿地沉积物中的微生物以细菌为主，细菌能参与湿地污染物和有毒物质的降解过程，有助于保持湿地生态系统的平衡和提高湿地自净能力。松江湿地的内部环境和结构较复杂，沉积物中蕴含着丰富的微生物资源，其细菌组成结构能良好地反应湿地环境因子的变化，深层次理解松江湿地生态系统结构和功能，而建立优化PCR体系是利用T-RFLP技术分析微生物资源的前提条件。 　　末端限制性片段长度多态性（terminal restric-tion fragment length polymorphism， T-RFLP），又称为16S rRNA基因的末端限制性片段（terminal re-striction fragment，TRF）分析技术，是建立在PCR基础之上研究微生物多样性的一种新兴分子生物学研究方法，不依赖于培养即可对微生物进行群落结构分析，具有非常广阔的应用前景。T-RFLP技术具有快速、高度的可重复性、良好的可操作性和产生大量的可操作单元（OTUs），能够与数据库建立直接联系，用于微生物菌种鉴定、群落的对比和多样性分析。本研究对在松江湿地沉积物细菌T-RFLP分析过程中，PCR扩增体系的相关影响因素进行优化和筛选，建立适于湿地沉积物的简单、高效和稳定的PCR反应体系，为进一步开展沉积物细菌群落结构研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　沉积物于2012年8月采自松江湿地哈尔滨段，采集深度为0～20cm，将沉积物用无菌塑料袋密封带回实验室，-20℃冷藏。 　　PCR试剂所用试剂Taq酶、Mg2+、dNTPs和标准相对分子质量Marker（简写为M） DL2000均购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司，引物由上海生物工程有限责任公司合成。 　　1.2试验方法 　　DNA提取及检测：采用MOBIO土壤微生物DNA强力提取试剂盒对0.25g沉积物进行微生物总DNA提取，具体方法按照制造商的说明使用，所提取的DNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测其纯度。 　　PCR扩增程序与正交试验设计：采用细菌16S rRNA基因通用引物8F（5-AGAGTTTGATC-CTTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3）进行PCR扩增，正向引物8F用6-FAM（羧基荧光素）标记在5的末端。 　　PCR扩增程序如下：95℃预变性5min， 95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，循环34次。最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为lxTAE，205V稳压电泳8min，在紫外光成像系统下照相并记录分析。 　　在进行单因子试验分析影响因素之后，为快速准确地确定PCR最优反应体系，采用L16（45）正交设计，对PCR 5个因素（模板DNA、Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物）在4个水平上进行试验，20μL扩增反应体系（见表1）。 　　2结果与分析 　　2.1单因子试验与分析 　　2.1.1模板DNA含量 　　模板DNA的浓度与纯度是PCR是否成功的关键因素之一，DNA含量过高，会结合Mg2+，降低Taq酶的活性，产生非特异性扩增；DNA含量过少，PCR产物少且不稳定甚至无扩增。由图1电泳结果可知，DNA含量在l0～40ng之间均可扩增出条带，DNA含量在10ng时条带弱且不清晰，增加到20～40ng时条带均亮，所以选择20～40ngDNA含量为最佳。 　　2.1.2Mg2+浓度 　　Mg2+对PCR扩增的产量和特异性有显著的影响，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物相结合，影响引物与模板的结合效率、模板与PCR产物的解链温度和产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2+浓度过高会降低PCR反应的特异性，出现非特异性产物；浓度过低会抑制Taq酶活性，降低PCR扩增产量。由图2电泳结果可知，Mg2+浓度在2.5mmol/L时条带颜色浅；2.0mmol/L时条带较亮；当降低到1.5、1.0mmol/L时条带逐渐变浅且弥散。因此，Mg2+最佳浓度为2.0mmol/L。 　　2.1.3dNTPs浓度 　　dNTPs是PCR扩增反应的原料，其浓度过高时，会导致聚合酶错误的掺入，并引起碱基错配，降低PCR扩增的忠实性