高山被孢霉△6一脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达.docVIP

高山被孢霉△6一脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达 　　摘要：以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为报告基因，将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析，荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达，建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法 在此基础上，以高山被孢霉△6一脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因，构建重组质粒pRH2304MAD6，将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明，高山被孢霉△6一脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中，进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明，该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸，占细胞总脂肪酸的4.35%，但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。 　　关键词：红冬孢酵母；高山被孢霉；△6一脂肪酸脱氢酶基因；γ一亚麻酸；表达 　　中图分类号：Q786 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847（2014）04-0304-06 　　多不饱和脂肪酸（polyunsaturdted fatty acids，PUFAs）是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为18～22的直链脂肪酸，除了作为结构成分和信号分子对维持细胞膜正常功能和一些基本的细胞过程具有重要的调节作用外，PUFAs在人体内合成变化会导致多种疾病，比如心血管疾病、肥胖、非胰岛素依赖性糖尿病、高血压、神经性疾病和癌症等。PUFAs按照脂肪链甲基端引入的最后一个双键位置分为n-3和n-6两大类，亚油酸LA（linoleic acid C18：2，n一6）和α-亚麻酸ALA（α-Linolenic acid， 18：3 n-3）是n-6和n-3 PUFAs合成的前体，两者在不同脂肪酸脱氢酶（Desaturase）和延长酶（Elongase）的交替催化下分别转化成γ-亚麻酸GLA（γ一Linolenic acid， C18：3 n-6）、花生四烯酸AA （Arachidonic acid， C20：4 n-6）、EPA（Eicosatetraenoic acid， C20：4 n一3）和DHA （docosa-hexaenoic acid， C22：6 n-3）等多种PUFAS。同一种脱氢酶或者延长酶都可利用n-3和n-6途径中的脂肪酸作为底物进行催化，但是由于酶的底物偏好性特点会导致一条途径的脂肪酸转化增强，而另一条途径的脂肪酸转化减弱。 　　某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的20%以上，最高可达细胞干重的80%，这类微生物称为产油微生物。目前已报道的产油酵母包括耶罗维哑酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporid-ium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、毛孢子菌属（Tri-chosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）等一些种类，这些产油酵母油脂中富含PUFAs，而且油脂成分与常见的植物油相类似，因此可作为生活中植物食用油的替代品，具有重要的潜在应用价值，但是不含GLA。GLA是一种人体必须脂肪酸，是合成AA的前体，属于n-6类PUFAs，AA可进一步转化成前列腺素、白细胞三烯以及脂氧合酶或是环氧合酶的产物，这些产物在降血脂、抗脂质过氧化、抗炎、减肥、抑制过敏、增强胰岛素和抗血栓性心血管疾病等方面具有重要的生理功能，但是现有GLA商业来源难以满足日益增长的市场需求，借助于基因工程手段构建产高GLA菌株可作为潜在的替代来源之一。本研究将高山被孢霉（Mortierella alpina）△6-脂肪酸脱氢酶基因转化到产油酵母――红冬孢酵母（Rhodosporidium， Kra-tochvilovae）YM25235中进行表达，使其产GLA，类似的研究在红冬孢酵母属中未见报道。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株、质粒和培养条件 　　红冬孢酵母（Rhodosporidium Kratochvilovae）菌株YM25235由昆明理工大学嗜极微生物研究室保存，质粒pRH2304（图1）购自新加坡民族大学，具有高山被孢霉（Mortierella alpina）△6一脂肪酸脱氢酶基因（MAD6，GenBank： AF307940）的T载体pTMAD6由南开大学李明春教授惠赠；菌株YM25235在YM培养基（酵母膏0.3%、胰蛋白胨0.5%、麦芽糖0.5%，pH自然）中30℃条件下培养。 　　1.1.2主要试剂 　　酵母总DNA提取试剂盒为上海生工产品DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶和DNA胶回收试剂盒购自大连宝生物工程公司，潮霉素以