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利用SSR分子标记初步分析广西莪术种质资源的遗传多样性 　　摘要：利用简单重复序列分子标记技术对广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）种质资源进行了遗传多样性分析。结果表明，筛选出的14对引物在50份广西莪术种质资源中共扩增出78个条带，其中60条呈现多态性，多态性比率为76.92%，反映出广西莪术种质资源在分子水平上存在较大的差异；广西莪术不同种质资源间的差异主要由遗传因素决定，但也与环境因素有关。聚类结果将50份广西莪术种质资源分成2大类，揭示了它们之间的遗传差异，这为今后广西莪术优良品种的选育提供了依据。 　　关键词：简单重复序列分子标记；广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）；遗传多样性 　　中图分类号：Q943.2；Q949.71+8.33；Q16 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2408-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.027 　　广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）为姜科（Zingiberaceae）姜黄属（Curcuma L.）植物，以干燥根茎入药，其味辛、苦，性温，具有行气破血、消积止痛的功效，可用于症瘕痞块、淤血闭经、食积胀痛等病征以及早期宫颈癌的治疗，是中医临床上较为常用的活血化瘀药材[1]。现代药理研究表明，广西莪术所含的莪术油是一种很有发展前途的抗肿瘤、抗血栓和抗病毒药物[2-4]。广西莪术是广西壮族自治区主产的地道药材，产区面积大，近年来关于莪术挥发油成分的研究越来越多，但对广西莪术的品种选育和种植技术改良未受到应有的重视。多年来，广西莪术育种工作侧重于常规技术，许多分子水平上的研究工作有待开展。试验利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记技术对产自于广西壮族自治区的50份广西莪术种质资源进行了遗传多态性分析，旨在揭示广西莪术种质资源的遗传多样性，以期为广西莪术选育高产优质新品种提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 植物材料 　　供试广西莪术种质材料共有50份，是从多年收集到的广西莪术原始材料中选育出来的，分别采自广西壮族自治区的玉林市、兴业县、钦州市、灵山县、贵港市、桂平市、平南县、钦北区、横县、邕宁区、金秀瑶族自治县等地，从2000年起集中栽植于南宁市仙葫种植基地内。试验前其生长状况优良，有关信息见表1。经王建教授鉴定，并经过药材性状数据分析，参试的各样品确认为姜科植物广西莪术无疑。 　　1.2 基因组DNA提取 　　选取参试各种质材料生长状况良好的新鲜健康嫩叶，经前期消毒处理后提取DNA，提取方法参照经典的CTAB法[5]，稍加改良。提取所得总DNA于-20 ℃环境里保存。 　　1.3 引物筛选和SSR-PCR反应体系优化 　　聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增引物参照文献[6]公布的姜黄属通用的17对引物选取，由上海生工生物技术工程服务有限公司合成，详见表2。随机选用10个参试的广西莪术种质材料，参照Komatsu等[7]的SSR扩增条件稍加改良进行引物筛选，从姜黄属通用的17对引物中选取扩增条带清晰、重复性好、多态性高的15对引物作为本次试验的引物。最终确定的PCR反应体系为：DNA模板3 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 6 μL（Taq DNA Polymerase）、Recombinant 0.05 units/μL、MgCl2 4 mmol/L、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）0.4 mmol/L、加dd H2O至15 μL。以此建立的SSR反应体系稳定、重复性好。PCR反应程序参照文献[8]，略有改动；扩增反应是在德国Biometra TProfessional PCR仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个扩增循环；最后72 ℃延伸10 min。 　　1.4 凝胶电泳与染色 　　PCR产物在7%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS，5 μg/mL）中于200 V稳压里电泳45～60 min，凝胶电泳分离后进行银染，观察，并用Cano Scan 9 000 F扫描仪扫描得到图谱。 　　根据图谱分析各SSR位点的扩增情况，包括是否扩增、各位点在不同材料中所得到的等位基因数量。 　　1.5 遗传多样性分析 　　电泳扩增结果直接记录凝胶带型，并按基因型分别统计。选取清晰