08_现代分子诊断技术.pptVIP

7.5.2 PCR/OLA鉴定 OLA （oligo-nucleotide ligation assay)寡聚核苷酸连接分析 PCR/OLA鉴定的原理： 假定一个正常基因在一个特定位置发生了突变，比如说150位的T突变成了G。根据150位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段核苷酸链与基因的一条链互补，重要的是使其中一条寡聚核苷酸链（探针X)的3’端最后一个碱基正好与正常基因的150位核苷酸配对，而另一寡聚核苷酸链（探针Y)，与151位的核苷酸配对。如果150位没突变，加入DNA连接酶，两个探针就可以连接起来，如果150位有突变，则两个探针无法连接。 检测X和Y两个探针是否实现连接的方法 在探针X的5‘端标记上生物素，而在探针Y的3’端标上地高辛（digoxigenin,DIG,抗体结合的指示剂) 第一步当杂交和连接步骤完成后，先使DNA变性，将杂交探针释放出来，然后将混合物转至一连有链霉素抗生物素蛋白的小孔中，冲洗洗去未结合的杂质只有生物素标记的探针DNA 还结合在链霉抗生物素蛋白上； 将连有碱性磷酸酶的抗DIG的抗体加到小孔中然后冲洗，去除未结合的抗体； 加入一种无色的生色底物。如果小孔中出现颜色，表明DIG抗体结合到了DIG了，而经DIG标记的探针也与经生物素标记的探针实现了连接，如果没有颜色说明没有实现连接。 加入链霉抗生物素蛋白 加入碱性磷酸酶 有色 无色 实际检测中通常用两套探针，一套是两个带有正常序列的寡聚核苷酸链，另一套是带有一个突变位点的两个寡聚核苷酸链，这样可以准确判断出所有被检测人的遗传物质情况 PCR/OLA检测技术的发展：目前用机器 来完成PCR/OLA分析检测，一天可以作1200个连接反应的检测；在OLA技术的基础上发展出了固相OLA技术 固相OLA技术：将一个特异性探针固定化于硅胶、玻璃等固体支持物上。固定化的探针可以特异性地捕捉待测样品中与之相配对地目的DNA然后加入生物素标记短的另一个特异性探针，彻底洗去非特异性结合的游离探针后进行连接。固相OLA技术的特异性强，灵敏度高，易于自动化。 7.5.3 LCR 鉴定 LCR(ligase chain reaction, 连接酶链式反应） LCR鉴定的原理：设计两对引物1、2和1’、2’，1和1’，2和2’互补，1、1’和2、2’又分别与模板DNA 链的一条链互补，模板DNA变性后，两对引物分别与模板链退火，退火后引物1’和2的3’端与引物1和2’的5’端紧紧相邻，如果引物与模板链完全互补，则相邻引物可以在连接酶的作用下连接起来。只有当引物在连接酶的作用下连接起来，才能够以之为模板进行进一步扩增，从而引发链式扩增反应。 变性后与引物退火 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 5‘ 3‘ 无法进一步扩增 不能连接 3‘ 5‘ 突变型 野生型 连接 变性后与引物退火 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 1 1’ 2’ 2 5‘ 3‘ 进一步扩增 T4 DNA连接酶 LCR检测的注意事项 两个引物的的量要大大过量 在杂交系统中要加入一种耐热的DNA连接酶，当第一个连接反应在65℃进行后，新的连接反应仍然能够完成。 LCR检测方法的发展： 连接酶检测反应（ligase detection reation,LDR) 缺口LCR（gapped LCR,G-LCR) 多缺口LCR(polygapped LCR,P-LCR) 7.5.4 PCR-ELISA检测 PCR-ELISA方法是指用ELISA法检测PCR产物的方法，其中最常用的是双标记寡核苷酸俘获分析法（Dual-labeled oligonucleotide capture assay, DL-OCA) 双标记寡核苷酸俘获法基本原理：在PCR反应体系中加入生物素标记的dUTP(Bio-16-UTP)和其他三种dNTP，这样在扩增反应中生物素标记的核苷酸就会掺入新合成的DNA链中，电泳后除去游离的dNTP、引物和引物的二聚体后，用3’端经DIG标记的特异性探针与之结合，然后加到包被又抗生素抗体的酶标板上，再洗去未结合的游离探针后，在酶标板上加入抗碱性磷酸酶（AP)－DIG抗体，如果加入DIG标记的探针可以与扩增片断结合，则酶标板上有颜色反应。否则