抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达.docVIP

抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达 　　摘要：利用生物信息学方法优化了适用于原核表达的Bar基因序列密码子，克隆了Bar基因序列并构建了pET28a-Bar融合表达载体，并转入大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）。结果表明，融合表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式表达膦丝菌素乙酰转移酶（PAT蛋白质），并通过镍离子亲和层析纯化后获得了PAT蛋白质，该纯化蛋白质的获得为利用酶联免疫法定量检测和筛选转基因植物提供了必要前提。 　　关键词：Bar基因；膦丝菌素乙酰转移酶；原核表达；分离纯化 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2515-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.058 　　Bar基因作为筛选标记基因，具有快速、简便、高效、转化细胞产生的假阳性个体少等优点，被广泛应用于转基因玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max）、油菜（Brassica campestris L.）、水稻（Oryza sativa L.）、小麦（Triticum aestivum Linn.）和大麦（Hordeum vulgare L.）植物基因工程研究中[1-3]。Bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），其能够使草丁膦的有效成分――膦丝菌素（PPT）失活，从而解除除草剂的毒性。Bar基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因[4]。目前，生物技术育种的阳性转化体筛选多数依据Bar基因表达的草丁膦除草剂耐受性进行表型鉴定筛选。而由于其不同时代单个转化体的外源基因表达稳定性未知，表型筛选易受环境等因素影响，导致了鉴定准确性不高。转基因植物标记基因的检测方法主要有表型鉴定、PCR鉴定、ELISA和Western印迹等方法[5]。ELISA分析法特异性高，获得结果快，仪器操作简单，同时可降低检测成本[6-8]。建立Bar基因原核表达体系，表达和纯化PAT蛋白质可为转基因转化外源蛋白质提供参考，本研究通过密码子优化和全基因合成，获得了适合原核表达的Bar基因片段，并分离纯化得到的高纯度PAT蛋白质，可作为抗原为制备多抗和单抗打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株与质粒 原核表达载体pET28a （+）、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和大肠杆菌DH5α由吉林省农业科学院生物技术研究所转基因安全评价室保存。 　　1.1.2 酶及试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、引物Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG、十二烷基磺酸钠（SDS）和β-巯基乙醇购自Promega公司；Ni-NTA His Bind Resin、层析柱购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 克隆基因片段 以合成引物PCR扩增Bar基因全长，然后用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ内切酶分别酶切pET-28a载体和扩增片段，将扩增片段连接pET-28a载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞。利用PCR扩增鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名为pET-Bar。提取质粒pET-Bar并转化到BL21（DE3）感受态细胞。挑取含pET-Bar质粒的单克隆菌落，接种于100 mL含有氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 ℃振荡培养过夜。次日用LB（Amp+）稀释至1 000 mL，37 ℃培养至OD600 nm为1.0左右，加IPTG 至终浓度为1 mol/L。37 ℃继续培养6 h后4 ℃、 5 000 r/min 离心10 min，收集沉淀并用PBS洗涤。 　　1.2.2 密码子的优化 利用SignalP 3.0 Server软件预测Bar基因序列有无信号肽及其位置；利用TargetP 1.1Server软件检测此信号肽的功能。将链霉菌中Bar基因密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将Bar基因密码子改造为大肠杆菌偏好密码子。 　　1.2.3 表达载体的构建 将含有目的基因的片段切下并用胶回收试剂盒回收，再与同样酶切处理的载体pET28a连接，并转化大肠杆菌DH5α，碱解法提取质粒，根据酶切鉴定结果，筛选含有Bar基因的重组质粒命名为pET28a-Bar。摇菌过夜培养，取1 mL菌液送北京鼎国昌盛生物技术公司测序以确定基因序列。 　　1.2.4 外源基因的诱导表达 将含有pET28a-Bar表达载体的BL21 （DE3）菌株于37 ℃活化过夜后，按4∶100稀释到20 mL含有60 mg/mL卡那霉素的LB培养基中。振荡培养至