植物表达载体构建讲解.ppt

（四）植物基因转化载体系统的构建： 1．一元载体系统的构建： （1）共整合载体的构建 （2）SEV的构建： 即T-DNA边界拼接系统，亦称拼接末端载体（split-end vector，SEV），是另一种共整合载体。因为它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。 其构建过程如下图。 SEV的构建过程： 1）SEV的受体Ti质粒是pTiB6S3-SE，来自野生型质粒pTiB6S3的突变体。它的TL-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已经缺失，T-DNA的保留部分被称为“左边界内部同源区”（left inside homcology，LIH），即左边界内部同源序列。该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因（Knr）。 2）SEV中间载体是pMon200或pMon120。它含有一个胭脂碱合成酶基因，一个在细菌里编码的壮观酶素抗性基因（Spcr）、链霉素抗性基因Strr和Npt-II基因，特别是它具有与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR。 3）通过三亲杂交将中间载体pMon200导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源序列，即可发生同源重组，形成SEV的共整合载体。SEV包含有分别来自两个质粒的左右边界及Vir基因，成为一个完整的非致瘤性Ti质粒。由于pMon200中间载体带有抗性嵌合基因，因而转化的植物可以直接进行筛选。 （3）SEV和pGV3850的比较： 两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，同属于共整合的一元载体系统，但它们之间有一定差异： 1）它们的受体Ti质粒和中间载体的结构不同。pGV3850的左右边界在一个受体Ti质粒上，而SEV来自两个质粒，即TR来自中间载体。 2）同源序列不同。pGV3850重组的同源序列是 pBR322，而SEV是LIH。 3）SEV是更有效的共整合载体。由于pGV3850 共整合载体带有大肠杆菌pBR322序列，外源基因嵌合在该序列中，因而转化的植物中也带有重复的 pBR322序列。此重复序列可能对转化植物中外源基因的稳定性有影响，而SEV系统则排除了这种可能性。 （四）植物基因转化载体系统的构建： 1．一元载体系统的构建 2．双元载体系统的构建： 双元载体（binary vector）系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统，也因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体（trans vector）。 * * 第五节 植物基因工程载体 在植物基因转化研究中已建立了多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。 一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因 （五）T链整合植物基因组的分子机理： 1．整合位点及其特性： 遗传作图的分析表明，T-DNA在植物染色体上的插入是随机的，可插入任何一条植物染色体。但插入位点常有以下特点：①T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；②T-DNA与植物DNA连接处富含A、T碱基对；③植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。Matsumoto等人认为，正是由于这种同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地发生DNA链的交换。 在T-DNA的整合过程中还常发现植物基因组靶序列