崂山奶山羊胎儿成纤维细胞SOD1和APOE基因差异表达分析.docVIP

崂山奶山羊胎儿成纤维细胞SOD1和APOE基因差异表达分析 摘要 选择SOD1和APOE基因，研究其在不同代数奶山羊胎儿成纤维细胞中的差异表达。分别收集正常生长的第F2、F8、F16、F32、F40、F50代胎儿成纤维细胞，提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术及实时荧光定量PCR技术检测不同代数崂山羊胎儿成纤维细胞SOD1和APOE基因的表达，结果表明：崂山奶山羊SOD1和APOE基因在第2代成纤维细胞中表达水平最高，随着传代次数的增多，表达量逐渐下降，第50代表达量最低，而且SOD1和APOE基因的表达趋势完全一致，由此表明SOD1和APOE基因在不同代数崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中有选择表达的趋势，为进一步揭示细胞衰老机制提供参考。 关键词 崂山奶山羊；胎儿成纤维细胞；SOD1；APOE；荧光定量 中图分类号 S813 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）12-0268-01 人们在研究模式生物老化机理的过程中，发现各个器官的老化及机体的衰老受一些特定基因的调控。该文对崂山奶山羊胎儿成纤维细胞SOD1和APOE基因差异表达进行分析，以为进一步揭示细胞衰老机制提供参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料 主要试剂有DMEM（Gibco），胰蛋白酶（Biotopped），SYBRR Premix Ex TaqTM II试剂盒。 1.2 试验方法 1.2.1 崂山奶山羊胎儿成纤维细胞的分离和体外培养。从怀孕40日龄的奶山羊取出胚胎，将胎儿进行实验室原代及传代培养。 1.2.2 总RNA的提取及质量检测。采用Trizol法提取崂山奶山羊第2、8、16、32、40、50代胎儿成纤维细胞总RNA。 1.2.3 总RNA的反转录。用反转录试剂盒分别将不同代数的总RNA反转录成cDNA。 1.2.4 引物设计及PCR反应。参照GenBank中公布的奶山羊SOD1基因序列（NM_001285550）和APOE基因序列（XM_00座机电话号码），用Primer3（v. 0.4.0）在线软件设计特异性引物。 使用特异性SOD1上下游引物和APOE上下游引物分别对2～50代的崂山奶山羊胎儿成纤维细胞进行PCR扩增反应。 1.2.5 荧光定量PCR。实时荧光定量PCR检测SOD1和APOE基因的表达量。 2 结果与分析 2.1 细胞培养 根据2种细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，通过差速消化和差速贴壁法可获得纯化的成纤维细胞[1]，传至F2代时即可获得纯成纤维单层细胞。 2.2 总RNA提取、浓度测定结果 提取的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳后呈现3条带，分别为28 s、18 s、5 s；且28 s比18 s的亮度大2倍，A260/A280在1.79～1.92，RNA含量在375～789 ng/μL。 2.3 RT-PCR扩增结果 通过RT-PCR扩增，分别获得长度为207、172 bp的特异性片段，产物经琼脂糖凝胶电泳检测。SOD1和APOE基因在第2代崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中的含量最高，随着细胞传代次数的增加，SOD1和APOE基因表达量有逐渐下降的趋势，第50代二者表达量最低。 2.4 实时荧光定量检测结果 通过△Ct法来表明SOD1和APOE基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中表达[2]。SOD1和APOE基因在第2代崂山奶山羊胎儿成纤维细胞的表达量最高，随着细胞传代次数的增加，二者表达量均逐渐下降，其中第50代表达量最低，与RT-PCR结果相一致。 3 结论与讨论 试验以崂山奶山羊SOD1和APOE作为候选基因，以胎儿成纤维细胞为素材，通过荧光定量PCR检测SOD1和APOE基因在不同代数崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达情况。结果表明：SOD1和APOE基因在崂山奶山羊不同代数胎儿成纤维细胞的表达不同。SOD1和APOE基因在第 2代崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中含量最高，随着传代次数的增多表达量逐渐降低，其中第 50 代最低。分析可能是在第2代细胞新陈代谢快，产生ROS、脂质类物质等相对较多，需更多的SOD1和APOE将其清除或运输走。随着传代次数的增多，虽然细胞仍保持一定的分裂能力，但新陈代谢变得缓慢，细胞的各种功能开始退化，出现衰老现象[3-4]。因此，SOD1和APOE基因在不同代数崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中含量的变化可用作断定细胞是否衰老死亡的一个非常重要的指证。试验研究了崂山奶山羊SOD1和APOE基因在不同代数胎儿成纤维细胞中的表达，其结果具有重要意义，可以为将来研究人类衰老疾病而建立细胞模型提供参考[5-6]。 4 参考文献 [1] 刁睿鑫，张勇，胡俊杰，等.双峰驼胎儿耳缘组织成纤维细胞系的建立及其生物学特性鉴定[J].兽类学报，2012，32（4）：340-346. [2] 王春花，刘克明，张明月.SOD基因表达与衰老的