蔬菜盆栽采样硝态氮硝酸还原酶测定方法.docVIP

1.土培试验栽培方法： （1）采自大田耕层土，晾干后，捡出石块和根茬，将大土块敲碎，过3mm筛。过筛后的土壤要充分混匀。 （2）根据试验目的选取合适大小的盆钵，一般选用塑料盆，盆子大小应保持一致。禾谷类和豆科作物可选用20cm×20cm或20cm×25cm的盆钵，玉米、烟草、高粱和棉花可选用25cm×30cm或30cm×35cm的盆钵，。 （3）装盆前先试装一两盆，保持土层表面离盆沿3cm左右。称取土样，若须加入蛭石或珍珠岩等，应根据所需比例加入，并混匀（体积比2.5/1）。之后将称好的肥料和土样一块再混匀（若肥料颗粒较大，应先磨碎），装盆，将土平面抚平。播种前一天请按土壤25%的含水量浇水，静置至水分完全渗入，放置一天培养，第二日再播种。播种后覆上1cm厚的干土，然后再浇少量水，此后出苗前尽量不浇水。 2.采样方法： 采样时选取长势一致的植株，采样在早上9:00-10:00之间进行，采下的植株立即装入已做好标记的塑料袋，密封袋口，以防水分散失，然后根据分析目的先把油菜按器官分开（根、茎、叶柄、叶片），以防止硝态氮在各器官之间的转移。根系的采集可冲洗取出。迅速称量各器官、部位鲜重,取出测定硝酸还原酶活性的样品，其余部分，放入冰箱待用。 3.. 硝酸还原酶活性测定方法： （1）剪下有代表性的油菜叶片，将其切成0.5×0.5cm的小片， 叶柄切成厚0.1cm的小段 ,称取5份，每份0.5g。分别装入盛有10ml反应介质的50ml三角瓶中，其中3份反应介质为10mlPH7.5的0.05M磷酸缓冲液（内源基质法），并且其中1个三角瓶在加入样品前预先加入1ml30%的三氯乙酸作为对照，另外2份反应介质为5mlPH为7.5的0.1M磷酸缓冲液和5ml0.2MKNO3（外源基质法），对照和处理的三角瓶均放入真空干燥器中，抽气，使样品完全浸入反应介质，然后取出三角瓶，转入恒温箱，30℃下在黑暗条件下培养1个小时，培养完成后，取出三角瓶，立即在处理的4个三角瓶中也加入三氯乙酸，终止反应。 取上述反应液2ml于20ml试管中，再依次加入4ml磺胺溶液和4mlα-奈胺，混匀，在35℃下水浴锅中水浴30min或者在培养箱里保温30min 水浴效果较好 ，立即于520nm波长下进行比色。硝酸还原酶活性以每小时每克鲜样形成的亚硝酸钠的微克数表示。 酶活性（NO2- ug .gFW-1.h-1） C×V/a /FW×t C—从标曲上查出的NO2- ug数 V—反应液总量（ml） a---测定时取样体积（ml） FW---y样品鲜重（g） t---反应时间h（暗反应时间） （2）标准曲线绘制： 取七支试管按下表添加试剂： 试管号 1 2 3 4 5 6 7 NaNO2-标准液（NO2-5μg/ml 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 对氨基苯磺酸 4 4 4 4 4 4 4 α-奈胺试剂 4 4 4 4 4 4 4 每管含NO2-的μg数 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 加完溶液后混匀，在35℃下培养箱里保温30分钟，立即于520nm波长下进行比色。以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 硝态氮测定方法： 4. 从冰箱取出剩余的样品，叶柄、叶片每份准确称取2.5g（根称取1g），放入有编号的研钵中，加1ml30%的三氯乙酸（抑制硝酸还原酶活性）和少量石英砂（约0.5g），研磨至匀浆，用29ml蒸馏水准确地转移至50ml离心管中，以4000转/分的速度离心12分钟，吸取上部清亮液2ml,定容到100ml,（可以先少量测定几个样品，依所测定值范围确定稀释倍数）制成待测液，待测液中的硝态氮用连续分析仪测定。蔬菜硝态氮含量以mg/kg鲜重表示。 5. 连续流动分析仪操作流程 a根据管子的粗细、卡子颜色，参照示意图一根一根连接管子； b打开电源，先将吸液管放进蒸馏水中清洗30min左右； c将吸液管分别放进各自的试剂中， d设置色谱程序（附后），待反应管中气泡均匀和色谱图像上基线稳定（基本上为一平线）