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第二讲 糖的分析方法 一、中性糖的测定 1．还原糖的次亚碘酸盐定量法 适用：各种醛糖；适用于测定淀粉酶解时糖苷键水解的百分率，也可测定淀粉酶产物的寡聚糖链长。 基本反应： CH2OH CHOH nCHO+I2+3NaOH→CH2OH CHOH nCOONa+2NaI+2H2O 氧化 I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+ NaI 滴定 2．3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法 原理：在碱性溶液中，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 注意：该法不是化学计量反应，戊糖、已糖和双糖与DNS反应的生色度A500/μmol糖的值分别是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；双糖（麦芽糖、乳糖）：0.65。 有人认为还原糖的醛基被氧化为羧基，但当量不准确，不同的糖类产生不等等量的色度，表明它的化学反应是较复杂的。 3．Somogyi-Nelson法 还原糖将铜试剂还原成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560nm下的光密度与还原糖浓度呈比例关系。 注意：比方法重复性较好，产物稳定，测定范围10-180μg/mL。 4．苯酚-硫酸法 苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，已糖在490nm处，戊糖及糖醛酸在480nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。 注意： （1）该法颜色持久，较稳定； （2）每种糖的显色值不同，故不宜直接用于杂多糖的定量测定；分析杂多糖时，可根据各种单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 （3）有颜色的样品，测定值偏高； （4）此法较适于检测凝胶柱部分收集样品中相对糖量的分析。 5．蒽酮-硫酸法 糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。 注意：该法可用于多糖、单糖含量测定。色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定干扰。 6．地衣酚-硫酸法 糖经浓无机酸处理脱水产生糠醛或糠醛衍生物，生成物能与酚类化合物缩合成有色物质。 注意： （1）该方法操作较简便，广泛用于测定糖蛋白中总糖含量； （2）该方法的缺点是氨基糖存在时，可导致颜色降低，大量的色氨酸存在也可导致一些误差，但对中性糖的测定结果是可靠的。 （3）各种单糖的显色值不同，故用于杂多糖的定量测定时要注意。 7．戊糖的测定（地衣酚法） 戊糖与氯化高铁盐酸溶液或硫酸铁铵盐酸溶液一起加热，与地衣酚试剂反应，形成蓝绿色溶液，用比色法定量测定戊糖含量。 注意：此法可用于测定五碳糖，方法简单，但缺点是灵敏度较低，且因蛋白质、杂糖等干扰不易测准确。 8．已糖和6-脱氧已糖的比色测定 糖蛋白和蛋白聚糖（糖胺聚糖）中的已糖和6-去氧已糖可分别采用苯酚-硫酸法和半胱氨酸-硫酸法进行比色定量。若代之以苯酚-半胱氨酸-硫酸反应，则既可用于含上述两类糖基之一的匀多糖或杂多糖的组成测定量，也可以一次呈色，同时测定糖蛋白样品中两种糖基的含量。 注意： （1）适用于一种样品的两种已糖的同时测定。 （2）当应用本法于两类糖基的同时测定时，共存糖基间可能发生干扰。比如，高岩藻糖含量不影响半乳糖的测定，而半乳糖含量高时，会使岩藻糖含量偏高。 9．葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖 原理： 葡萄糖氧化酶 β-D-葡萄糖+H2O+O2 D-葡萄糖酸+ H2O2 H2O2+还原性染料（无色） 氧化型染料（有色） 注意： （1）葡萄糖氧化酶试剂最好现用现配，放置冰箱暗处可保存半个月。 （2）由于葡萄糖氧化酶液中同时混杂有麦芽糖酶和其它葡萄糖苷酶，如果达到专一测定糖化酶活力的目的，最好用Tris-甘油缓冲液，因为缓冲液中的两种成分都有抑制麦芽糖酶和其它葡萄糖苷酶的能力。 10．高效液相色谱法 由于糖类在紫外线外光、可见光、荧光下均无特征吸收，故糖类直接采用高效液相色谱测定有一定的困难。 直接检测糖类的检测品为：示差检测器、蒸发光散射检测器。 为提高糖类测定的灵敏度，通常将糖类经荧光标记或紫外标记后，再采用荧光检测器检测。 糖类的高效液相色谱检测目前只能用于单糖和低聚糖。所采用的色谱柱为糖类检测专用的糖分析柱，包括氨基柱和钙离子柱。 11．纸色谱法和薄层色谱法测定 该法既可用作定性测定，也可作为半定量分析方法。 该法既可分析单糖，又可分析低聚糖。半定量分析可通过薄层扫描进行。 12．糖的气相色谱分析 糖的气相色谱分析一般只用于单糖的定性和定量测定。 由于糖类无特征吸收，故采用气相色谱法检测进，先要对糖进行衍生化。 常的衍生化方法包括：三甲基硅醚衍生化、糖腈乙酸脂衍生化、糖醇乙酸脂衍生化、三氟乙酸脂衍生化