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小麦TaLTR基因的克隆及初步表达分析 　　摘要：以小麦山融3号为试验材料，克隆了TaLTR cDNA序列（Low temperature-responsive RNA-binding protein）。序列分析表明，TaLTR序列包含完整的ORF区，编码蛋白含有162个氨基酸，其氨基端包含一个RRM（RNA recognition domain）超家族保守的结构域，羧基端则富含甘氨酸；经半定量RT-PCR分析，表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。 　　关键词：小麦；TaLTR基因；RT-PCR；逆境胁迫 　　中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0025-05 　　小麦是约35%世界人口的主要粮食，其种植面积约占谷类作物种植总面积的三分之一。低温、干旱是影响小麦生产的主要非生物胁迫因子，研究小麦对干旱、低温等胁迫的响应机制，发掘逆境应答相关蛋白基因，对于研究小麦抗逆分子机制及增强抗逆性具有重要的理论和实践意义。 　　非生物逆境胁迫下，涉及离子转运与平衡、细胞生长和分裂、细胞防御和解毒、能量产生与运输以及渗透调节等生理代谢的大量基因的表达都会发生变化[1]。为此，山东大学夏光敏实验室利用SSH、基因芯片及双向电泳-质谱分析等方法，对耐盐抗旱小麦新品种山融3号盐或干旱胁迫前后的表达谱进行了分析，获得了大量表达模式发生变化的基因或ESTs信息[2～4]。本研究从山融3号盐胁迫前后的表达谱芯片结果中选取1个表达变化的EST（EST ID：WL403），对其进行了基因克隆、初步表达分析。 　　1材料与方法 　　11实验材料 　　111材料小麦（Triticum aestivum L）品种山融3号，由山东大学夏光敏实验室提供；菌株：大肠杆菌（Escherichia coil） DH5α（北京全式金生物技术有限公司）。 　　112试剂Trizol为Invitrogen公司产品；常用内切酶、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit为Fermentas公司产品；Taq酶使用宝生物工程（大连）有限公司产品Mighty Amp DNA Polymerase （hot start）；pEASY-T3载体为北京全式金生物技术有限公司产品。 　　12方法 　　121总RNA提取和cDNA合成Trizol法提取各取样时间点的小麦总RNA。根据Fermentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明，反转录合成小麦cDNA的第一条链。 　　122TaLTR基因的全长cDNA克隆分析小麦基因芯片和双向电泳结果，筛选小麦EST数据库，从对应ESTs中选择克隆一个盐胁迫下表达发生变化的基因。根据EST文库中拼接高度同源的ESTs序列，设计特异性引物TaLOW-S1/A1，扩增获得153 bp的小片段（TaLOW-S1：5′-TTAGGGTTTAGTAGTAGCGGGG-3′；TaLOW -A1：5′-GTCAGTGATGATCTTGGAGTCG-3′），经5′-和3′-RACE扩增，拼接后获得556 bp cDNA序列。利用ORF finder 程序（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）预测拼接序列的开放阅读框（ORF）。 　　使用Primer Premier 50 软件在预测的开放阅读框两侧设计特异引物TaLTR-F1/R1，得到一对能有效扩增TaLTR的引物（TaLTR-F1：5′-GAATGGCGGACGTCGAGT-3′；TaLTR -R1：5′-ATCGGGTAACTAGGATAACTGG-3′），以反转录的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，测序。 　　PCR程序为：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32循环；72℃ 10 min；16℃保存。 　　123TaLTR序列分析利用网站资源对TaLTR基因进行序列分析。NCBI进行nBLAST同源性比对；使用http：//auexpasyorg/ tools/dnahtml翻译TaLTR氨基酸序列；以InterPro Scan为工具分析蛋白质序列的结构域；运用MEGA31软件构建TaLTR基因编码蛋白的同源系统进化树；运用DNAMAN、clustalX软件构建多重序列比对图谱。 　　124基于半定量RT-PCR的初步表达分析挑选生长至两叶一心、健壮的山融3号小麦进行如下胁迫处理：200 mmol/L NaCl泡根处理72 h，然后恢复72 h；18% PEG 6000浸根处理72 h，随后恢复72 h；对照为正常条件下同期生长的健康植株。分