4-氯-1-萘酚显色.docVIP

别踢我 WB中的配置方法1 先配置0.3%的4-氯-1-萘酚4-氯-1-萘酚 30mg冷甲醇 10ml溶解后，摇匀 ，4度保存（2周）2 底物显色液的配置0.3%的4-氯-1-萘酚 5mlTBS 25ml30%双氧水 10ul3.?4-氯-1萘酚（4-CL-1-NapHthol）显色液 ??4-氯-1萘酚 100?mg ??无水乙醇 10?ml ??0.05MTB（PH7.6） 190ml ??30%?H2O2 10μl 配制方法：先将4-氯-1萘酚溶于无水乙醇中，然后再加入TB190ml，用前加入30%H2O2，显色时间5~20分钟。阳性结果为蓝或深蓝色。 免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有： 1、DAB（Diaminobenzidine）显色液 DAB即3，3-二氨基苯联胺 试剂：DAB（常用四盐酸盐） 50 mg 0.05mol/L TB 100 ml 30% H2O2 30～40 μl 配制方法：先以少量0.05mol/L（pH7.6）的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%，过滤后显色前加入30%的H2O 230～40μl，使其终浓度为0.01%。 DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24 h后使用。 2、4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液 配方1：4-Cl-1-萘酚 100 mg 纯乙醇 10 ml 0.05 mol/L TB pH7.6 190 ml 30% H2O2 10 μl （0.003%） 配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入TB19ml，用前加入30%H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。 配方2：4-Cl-1-萘酚、N-二甲基甲酰胺（DMF）、0.05mol/L TB（pH7.6）、30% H2O2。 配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50 ℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。 4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。 3、3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）显色液 试剂：AEC 20 mg 二甲基甲酰胺（DMF） 2.5 ml 0.05 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）　 　50 ml 30%H2O2 25 ml 配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。 该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。 4、TMB显色液 试剂：TMB、HCl、亚硝基铁氰化钾、无水酒精。 配制方法： （1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。 （2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。 （3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。 （4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5 ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。 （5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O21.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液