生物学综合性实验.ppt

* 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)由丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。在凝胶聚合中，丙烯酰胺单体分子中的双键先打开，相互连接形成脂肪族长链分子，再由交联剂亚甲基双丙烯酰胺随机地与长链上的游离功能机团反应，构成三维网状结构的凝胶。 打开丙烯酰胺双键必需的自由基由引发剂过硫酸铵(APS)提供。凝胶聚合反应的催化剂为四乙基乙二胺 (TEMED)。 （3）灌制胶板将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。 4）凝胶制备过程中的注意事项 a) 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 b) 溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。c) 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。  5　凝胶电泳　　扩增反应结束后，热变性,低温冷却,每个DNA样品取2μl，在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，在常压、110W下，电泳2小时 预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（本实验中采用常规的梳子，不必如此） （2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。 （3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。 （4）先将水浴加热至55℃后进行预电泳。 （5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟（恒功率80-90W,约30min）。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响实验的结果。（6）预电泳的注意事项 a) 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果；b) 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪；c) 厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。 上样及电泳（1）关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素。 （2）PCR扩增产物:甲酰胺上样液（98%甲酰胺，10mmEDTA，0.25%溴酚兰,二甲苯菁）8:3混合，95℃变性8min，然后立即冰浴。如果样品长时间不用，则应重新处理。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。AFLP选择性扩增产物95℃变性8min，然后立即冰浴。 （3）立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，0.4mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。(4)结束电泳 待二甲苯菁至三分之二玻璃板长度处,停止电泳. 银染的原理 是利用银离子(Ag+)渗入凝胶中与DNA分子结合成稳定的复合物。然后在碱性条件下，用甲醛作为还原剂使金属银析出，呈现黑褐色银沉淀而现显出DNA分子条带。 6 银染或放射自显影 得到被扩增的DNA谱带，通过比较即可找出不同样品 DNA谱带的差异。 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 （1）电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在长玻璃板上。 （2）固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定溶液（醋酸溶液）浸没,充分振荡20分钟或至样品中染料完全消失，胶可在固定溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定溶液，用于终止显影反应。 作用使胶转化为酸性状态,银离子好与DNA结合 该步骤不足,会使硝酸银结合的特异性降低,造成染色本底过高,故胶色发深 。 （3）洗胶：用超纯水振荡洗胶2次，每次8分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽，再进行下一次洗涤。 (4）凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 (5) 显影 显影液的配制：在已冷却至10℃的碳酸钠溶液(或NaOH)中，加入37%甲醛(3ml)和10mg/ml的硫代硫酸钠溶液(400μl)。往染色盘中倒入预冷的反应液1升，放在一边，其余反应液仍放在冰浴中。 b) 胶从染色液中取出，放在一边，染色液回收到烧杯中，盘清洗后加入超纯水。 c) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。凝胶从超纯水转移到显影溶液的