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生命科学学院 二号黑体居中 《家畜繁殖学》 实验教学教案 （小初号行楷居中） 主讲教师 授课班级 学 期 《家畜繁殖学》实验教学教案 [实验项目] 实验一 孕马血清促性腺激素和促卵泡素的生物效价测定法 [教学时数] 2+2课时。 [实验目的与要求] 1．测定妊娠母马血清中促性腺激素 PMSG 的生物效价。 2．校验孕马血清促性腺激素 PMSG 生物制剂及促卵泡素 FSH 生物制剂的生物效价。 [实验原理] FSH为垂体促性腺激素，作用于即将达到性成熟年龄的雌幼小鼠，促进了卵巢上的 卵泡发育，分泌雌激索。在雌激素的作旧下，又促进了小鼠子宫、卵巢及整个生殖器官的发育、增大。PMSG因为含有FSH、LH成分，因此具有与FSH、LH相同的生物学作用。也能促使性成熟前的小鼠子宫发育增大。 PMSG是一种高分子蛋白质激素，分子量要比FSH大，在机体内的作用期也比FSH 长，因此在测试效价过程中，PMSG可作一次注射，而FSH则需经多次注射，才能达到 预期的生物效应。 将PMSG或FSH供试品，按照不同稀释梯度来作为测试组，注射药物的小鼠根据子宫增大的程度和对照组相比较，能促使小鼠子宫增大一倍者，确定为阳性反应。在各测 试组中，将呈现阳性反应的最小剂量确定为一个小鼠单位 MU 。 [实验材料与设备] 1、实验动物 取健康无伤残的18—23日龄 即将达到性成熟日龄 、体重9—13g 同源雌幼小鼠。各测试组内的实验鼠出生日龄相差不得超过3天，体重相差不得超过3g。 2、测试样品 孕马血、PMSG、FSH生物制剂。 3、器械及药品 1ml注射器、4号针头、0.1m1微量注射器、1m1和2m1吸管、酒精棉球、生理盐水、剪子、大号镊子、带齿小镊子、鼠解剖台 或用小木板及图钉 、玻璃片 20 x 30cm 、鼠罐、小玻瓶。 [测试方法] 一、测试组的确定 1、PMSG测试组的确定 每取0.1ml孕马血清．按表1加入不同量的生理盐水、稀释成不同浓度，作为各测试组（表1）。如测试效价含量高的冻干制剂，可作10倍稀释，在行测试。 2、FSH测试组的确定 FSH系粉级粉剂瓶装，故在配成不同浓度的测试组之前，需用一定量的生理盐水稀释成液体。测定出每毫升溶液中的效价后，即可换算出该样品瓶内的FSH的效价值。每只鼠注入的FSH样品瓶可用1ml生理盐水稀释作为母液，并于0-5℃下保存，因为在常温条件下，稀释后的FSH容易失活，效价降低。 应为FSH母液需分作5次给小鼠注射，故每次的注射剂量是总量的1/5。因此，配制好的母液0.2ml加生理盐水0.8ml，经一次稀释成工作液，再取工作液0.1ml，按图1所示加入不同量的生理盐术，即可配成不同浓度的测试组。 一个FSH样品瓶经1ml生理盐水稀释成的母液，可配成10个测试组，为50只实验小鼠注射。 图1 FSH生物学测定流程图 二、对照组 在给测试组雌幼小鼠注射被测激素的同时，给对照组雌幼小鼠注射同样剂量的生理盐水。 [检定方法] 一 注射 1．注射次数 按各测试组要求，按照稀释成不同浓度的一定剂量，每个侧试组需注射5只雄幼小鼠。孕马血清只作一次注射，而FSH的剂量需分作5次注射。对照组亦为5只雌幼小鼠，在每次给各测试组小鼠注射的同时，注射同样剂量的生理 盐水。 2．注射部位 按照各组要求的药物剂量，准确地注射于小鼠的皮下。注意不得将药液注射于胸腔或腹腔内，亦不可溢漏于体表。 3．剂量 每只小鼠注射剂量为0.2ml。 4．注射方法 用手指捏住小鼠的头及尾部固定之，以酒精棉球消毒其背纸，提起皮肤，将注射针头平铺刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。注射计头宜选用小号细针头，以防止注射后的药液从针孔处溢出。 二 剖捡 l.剖捡时间 测试小鼠应在注射药物后的72—76h内进行。 2.剖捡步骤 1 处死小鼠 采用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感 到颈椎部位脱曰的振动。也可采用将小鼠头部经撞击致死。然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。 2）剖腹 将处死并固定好的小鼠，沿腹中线剪开腹腔，向前方揭去肠胃内赃，即 可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角。 3 组织剥离 将卵巢及子宫周围的组织剥离，于膀胱的后阴道段剪断，夹住膀胱 向上提起，即可将子宫及卵巢摘出。 4 剔除附属组织 按各测试组的顺序，将摘出的子宫平置于玻璃板上，剔出子宫 周围的附属组织。为了防止子宫干涸，可滴上数滴生理盐水浸润。 三 效价确定 将各测试组雌幼小鼠的子宫与对照组子宫相对比观察。在每组5只 雌幼小鼠中，若有3只鼠的子宫增大一倍者，则确定该组为阳性反应组。根据各测试组