PCR鉴定乳酸菌详解.ppt

应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌 摘要 目的:植物乳杆菌 、鼠李糖乳杆菌 、嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌是微生物肥料生产中常用的乳酸菌，它们表型特征相似，若采用传统方法鉴定则费时费力，为准确、快速地鉴定这些菌种，建立种特异PCR方法。 方法:利用 NCBI 中 Primer-BLAST (引物设计和特异性检验工具)，以 GenBank 数据库中上述菌种的 recA 和 gyrB 为靶基因，设计和筛选种特异性引物从而建立相应特异 PCR 鉴定方法。 摘要 结果：经过乳杆菌属、 乳球菌属、 片球菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和假单胞菌属7 个属 24 个种共 40 株标准菌株的实验验证， 4 个目标种分别扩增出唯一的目的产物，而其他种均无目的扩增产物。采用建立的 4 种特异 PCR 方法对产品中分离的 16株乳杆菌进行鉴定，结果与 16S rDNA 序列分析、 Biolog 鉴定结果一致。 摘要 结论：建立的特异PCR 鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性，可快速、准确的用于微生物制剂中植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌的检测和鉴定，具有较好的应用前景。 引言 乳酸菌是指能发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。具有多种重要的生理功能，是食品和药品行业中的重要菌种。在微生物肥料行业，以乳酸菌(主要是乳杆菌)作为有效菌的产品越来越多，准确的识别和鉴定微生物制剂中的各种菌是产品质量判定的重要依据， 而选择一种快速而准确的鉴定方法尤为重要。 引言 引言 材料与方法 1.2.1 基因组 DNA 模板的制备：乳酸菌接种MRS 琼脂培养基，37 °C 厌氧培养 16?24 h，胶冻样类芽孢杆菌接种于硅酸盐细菌培养基，其他菌株接种于营养琼脂， 30 °C 培养 16?24 h，用无菌水收集培养物，参照 Bead-beater 法并作一定改进快速提取各菌株的基因组 DNA。 材料与方法 1.2.2 种特异性PCR引物设计：通过分析比较GenBank 数据库中上述菌种及其相近种的16SrRNA、gyrB、recA、hsp60、16S-23S ITS、 lacZ 等基因序列的差异， 确定植物乳杆菌和德氏乳杆菌引物设计的靶基因为 recA (重组蛋白基因)， 鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌为 gyrB (促旋酶基因 )。利用NCBI中 Primer-BLAST (引物设计和特异性检验工具)设计引物并同时在GenBank 数据库中进行引物特异性验证，最终筛选出上述特异性引物各1对，分别为 planF/planR(植物乳杆菌特异引物) 、aciF/aciR (嗜酸乳杆菌特异引物)、 delF/delR (德氏乳杆菌特异引物)和 rhaF/rhaR (鼠李糖乳杆菌特异引物)。表 2 为各引物序列。 材料与方法 1.2.3 特异 PCR 反应体系及程序：以参考菌株的基因组 DNA 为模板，利用设计好的特异性引物进行 PCR 扩增。PCR 反应总体系为20 L，包括10×PCR Buffer (不含Mg2+ ) 2.0μL，MgCl2 (25 mmol/L) 1.6μL，dNTP mixture (各2.5 mmol/L)1.6μL，引物 F (20μmol/L)、引物 R (20 μmol/L)各0.5μL， Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2μL，模板 DNA50 ng，加无菌重蒸水补足至 20μL。PCR 扩增程序：94 °C 3 min；94 °C 60 s， 67 °C 45 s，72 °C 60 s，共 30 个循环；72 °C 10 min，4 °C 保存。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。 材料与方法 1.2.4 PCR 特异性验证实验：用 4 对引物分别对40 株参考菌株进行扩增，产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.5 特异 PCR 产物测序：对菌株 L. plantarum CGMCC1.2437T ， L. rhamnosus ACCC10534T ， L. acidophilus CGMCC1.1878T ， L. delbrueckii subsp. delbruekii CGMCC1.2624T 的 PCR 产物进行测序，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 1.2.6 生产菌株的检测：采用 Biolog 方法和 16SrDNA 序列