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辽宁绥中地方梨种质的SRAP分析 　　摘要 采用SRAP分子标记方法对辽宁省绥中县地方梨品种秋白梨、绥中谢花甜、水红宵、粉红宵、洋红宵及8个秋白梨可能变异单株进行遗传多样性和亲缘关系分析。从100对SRhP引物组合中筛选出9对引物组合，扩增条带数76条，其中多态性条带数43条，多态位点百分率为56.6%，具有较高的多态性；聚类分析将供试材料分为3组，遗传相似系数0.690～1.000。引物组合me2/eml、me4/eml、me4/em6、me7/eml可区分绥中谢花甜、粉红宵、水红宵、洋红宵、秋白梨及秋白梨单株1、2、4、7号；秋白梨1、2、4、7号在分子水平检测出变异。SRAP技术可有效地应用于梨的品种及芽变鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析。 　　关键词 梨 种质 SRAP 鉴定 亲缘关系 辽宁 绥中 　　辽宁省绥中县是我国白梨主要产区之一，主要品种有秋白梨、绥中谢花甜、粉红宵、水红宵等。秋白梨是我国北方古老而优良的梨品种之一，在辽宁省绥中县已有近千年的栽培历史，长期生产栽培可能已经累积了许多自然变异类型。通过常规鉴定，发现绥中县境内一些秋白梨单株在果实形状、单果重、心室数、果心大小、褐变度、石细胞含量等方面存在差异，疑似为秋白梨的变异单株，其是否为遗传变异需要进行鉴定。SRAP（sequence-relatedamplifiedp0ly-morphism）是一种基于PCR的DNA分子标记技术，具有操作简单快速、扩增稳定、不需要预知物种的基因组信息等特点，该方法已在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建、重要性状基因标记定位与克隆以及比较基因组学研究等众多领域得到广泛应用。本研究通过建立的梨SRAP-PCR反应体系，对5个绥中地方梨品种及8个秋白梨可能变异单株进行SRAP鉴定分析，从DNA水平研究地方梨品种的亲缘关系，并对秋白梨可能变异单株进行遗传变异检验，为梨芽变选种提供可靠的方法和理论依据。 　　1、材料和方法 　　1.1 试验材料 　　供试材料均采集自辽宁省绥中县，编号1～5为秋白梨可能的变异单株，6号为秋白梨原始品种，编号7～9为秋白梨可能的变异单株，编号10～13分别为绥中谢花甜、粉红宵、水红宵、洋红宵。2012年5月采集植株上的幼嫩叶片，称重分装后放在70℃超低温冰箱中保存备用。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 基因组DNA的提取 　　采用QIAGEN试剂盒法提取基因组DNA，用0.7%琼脂糖凝胶检测DNA的质量和完整性，放置于～20℃冰箱中保存备用。 　　1.2.2 SRAP标记分析与引物筛选 　　参照Li等公布的序列，合成正向引物mel～10，反向引物eml～10，组成100对引物组合，由上海生工生物工程有限公司合成。SRAP-PCR反应体系参考张妤艳等的方法，并对退火温度进行优化，为54.3℃。PCR扩增仪型号为Bi0-RadC100ThermalCycler。对100对SRAP引物组合进行2%琼脂糖凝胶筛选，筛选扩增稳定清晰的引物组合，对有差异引物组合重新扩增，产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 　　1.3 数据统计与处理 　　根据各扩增片段的迁移距离，将同一引物组合的电泳结果中稳定出现的条带（无论强弱）的有或无分别赋值为1和0，统计后形成（0，1）矩阵，利用NTSYS-pc2.1统计分析软件计算试验材料间的Dice遗传相似系数，采用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立系统聚类图。 　　2、结果与分析 　　2.1 DNA扩增结果及多态性分析 　　共选出扩增条带清晰、多态性好的9对SRAP引物组合。9对引物组合对13份供试材料共扩增出76条清晰条带，其中多态性条带为43条，占总带数的56.6%，平均每对引物组合产生8.4条带和4.8条多态性带。不同引物组合扩增的DNA片段大小为50～1000bp。引物组合me2/eml、me5/em7、me6/em3的扩增结果见图1。引物组合me2/eml扩增多态性比率最高（80.0%），引物组合me6/em5扩增多态性比率最低（0%）。引物组合me2/eml、me4/eml、me4/em6、me7/eml对供试材料有明显扩增差异带，可区分绥中谢花甜、粉红宵、水红宵、洋红宵、秋白梨及秋白梨单株1、2、4、7号。筛选出的9对引物组合3、5、8、9号秋白梨单株的扩增条带与6号秋白梨原始品种的SRAP带型均相同，未检测出变异；1、2、4号秋白梨单株与6号秋白梨原始品种在引物组合me2/eml、me4/eml、me6/em3上的SRAP扩增条带存在差异；与6号秋白梨原始品种的标准SRAP带型相比.有7对引物组合能对7号秋白梨单株扩增出特殊的SRAP条带。 　　对扩增结果计算遗传相似系数，13份供试材料的遗传相似系数变化范