消炎止灵片微生物限度检查法的研究.docVIP

消炎止灵片微生物限度检查法的研究 摘要：建立消炎止灵片的微生物限度方法。按《中国药典》2010年版微生物限度检查法进行验证和试验。经方法学验证试验得出的检查方法可用于独一味颗粒的微生物限度检查。 关键词：消炎止灵片；微生物限度检查；方法学验证 中药口服制剂容易受到微生物的污染，因此微生物限度检查是《中国药典》2010年版一部中药丸剂必检项目，是微生物污染状况控制的重要指标。当建立的微生物限度检查法时，应进行方法学验证，以确定所采用的方法是否适合该产品，使检验结果更具有有效性。因此本文通过对辽宁朝阳龙城制药厂提供的消炎止灵片不同批次进行了微生物限度检查法的验证，从而确定了该品种的微生物限度检查法。 1仪器与材料 1.1仪器 生物安全柜（BHC-1300ⅡA2），生化培养箱（SHP-150），隔水培养箱（JC303-3B ）。 1.2培养基和稀释液 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）。稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，按要求配制，灭菌。 1.3菌种 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉均由中国药品生物制品检定所提供。 2方法 2.1菌液制备菌液制备 接种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。 菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24h内使用。黑曲霉菌的孢子悬液保存在2～8℃，可在存储期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。 2.2供试液制备 取10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇，制成1：10的供试液。取1：10的供试液1ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：100的供试夜；取1：100的供试液1ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：1000的供试夜。 2.3细菌、霉菌和酵母菌计数的验证实验 验证试验分4组，进行3次独立的平行试验，并分别计算试验组的菌数回收率和稀释剂对照组的菌数回收率。 2.3.1供试液制备 依据《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法中供试液制备法：取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，作为1：10的供试液。①试验组 分别取1：10供试液1ml采用薄膜过滤法，加至100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，全量通过滤膜后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（约100ml/次，冲洗3次），分别加入50～100cfu试验菌悬液，待其通过滤膜，再加入50mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗内壁，取膜贴至营养琼脂培养基平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。②菌液组：取上述制备的菌液，照上述方法，测定所加的试验菌数。③供试品对照组：取1：10供试液1ml，采用薄膜过滤法加至100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，全量通过滤膜后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（约100ml/次，冲洗3次），取膜贴至营养琼脂培养基平皿中。④稀释剂对照组：取稀释液1ml和50～100cfu试验菌，按薄膜过滤法测定其菌数。⑤常规法检查白色念珠菌、黑曲霉。 测试结果见表1： 由表1数据可知， 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率均大于70%，试验组的菌数回收率也均大于70%，证明照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数方法可行。 所以，消炎止灵片的细菌计数可以采用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌采用常规法检查。 2.4 控制菌检查方法验证 阳性对照组检出试验菌，阴性对照组没有菌生长，试验组检出试验菌，所以消炎止灵片的控制菌检测方法可以按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的控制菌检查。。 3结论 3.1细菌计数方法可采用薄膜过滤法测定，消除甲氧苄啶的抑菌性，霉菌和酵母菌计数方法采用常规平皿法测定。 3.2大肠埃希菌、大肠菌群按常规法进行控制菌检查。 3.3注意不同的培养时间对样品细菌总数计数结果的影响 样品经24h培养后，有的菌落很小，容易漏掉，培养48h后，菌落不但变大，而且还有很多新