6DNA体外重组与基因转移精选.pptVIP

6 DNA体外重组与基因转移 6.1 重组DNA分子的构建 6.2 基因转移 6.1 重组DNA分子的构建 基因重组需要考虑的3个因素： （1）实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选。 （2）重组DNA分子应该能被一定的限制性核酸内切酶切割，以便回收插入的外源DNA片段。 （3）外源基因必须在表达载体DNA启动子的控制下，并置于正确的阅读框架中，以便目的基因的高效表达。 载体DNA与外源基因片段的连接 黏性末端DNA分子的连接： （1）单酶切粘性末端间的连接； （2）双酶切黏性末端间的连接； 平末端DNA分子的连接 同聚物加尾法 人工接头加尾法 单酶切粘性末端间的连接 双酶切黏性末端间的连接 平末端DNA分子的连接 黏性末端向平头末端的转变： 5’突出末端的补平：Klenow酶； 3’突出末端的切平：T4DNA聚合酶，S1核酸酶。 优点：连接任何的平末端DNA分子。 缺点： 效率低； 常破坏原有识别序列，也会产生新识别序列； 双向插入； 多拷贝插入。 同聚物加尾法 人工接头（连接子）连接法 6.2 基因转移 重组DNA向细菌细胞转入 化学转化法 电击转化法 外源目的基因向真核细胞转入 借助载体的基因转移 不需载体的基因转移： 磷酸钙沉淀法