不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析.docVIP

不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析 [摘要]为探讨不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的差异，采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义3个产地杜仲皮内生真菌，通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定，共分离得到152株内生真菌，分属于8个属，其中Phomopsis，Diaporthe，Alternaria为3个产地内生真菌共有属，各产地的优势种群不同。相似性分析表明，不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异；多样性及均匀度分析表明，慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高，分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低，优势种群集中，奇异度较高。拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析，不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。综合分析认为，杜仲皮组织的内生真菌具有多样性，慈利、遵义和略阳3个产地内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异。 [关键词]杜仲皮；产地；内生真菌；ITS；多样性 [收稿日期]2013-07-31 [基金项目]国家科技支撑计划项目（2011BAI01B08）；湖南省自然科学基金项目（14JJ4069）；湖南中医药大学研究生创新课题项目（2012CX04） [通信作者]*张水寒，教授，博士生导师，研究方向为中药资源、中药制剂及质量标准，Tel：（0731）座机电话号码， E-mail：zhangshuihan0220@126.com 杜仲Eucommia ulmoides Oli是杜仲科单属植物，为我国特有的经济树种，同时又是名贵的滋补药材。传统杜仲以树皮入药，药材的中心产区在湘西北、黔北、黔西及陕南等地[1] 。不同产地杜仲药材的品质有差异，据文献初步研究报道，外部环境因子如产地气候[2]、土壤[3]等可能是造成产地差异性的因素。近年来，关于杜仲内生真菌的研究逐渐引起了人们的重视，相关研究表明，杜仲内生真菌对多种病原真菌都有抑菌活性[4]，且从多种杜仲内生真菌发酵提取物中检测到与宿主相同的药效物质成分，如松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸[5-7]等，这些成分是评价杜仲药材质量的重要指标[8]。可见，杜仲内生真菌作为构成植物内环境的重要组分，对杜仲植物生长、其次生代谢产物积累及药材品质等均具有较大的影响。由于同一种植物生长在不同的环境，其内生菌的多样性及生物活性都有所不同[9-10]，本实验拟从杜仲内生真菌的角度，研究不同主产区的树皮内生真菌的种群结构的差异，分析差异产生的原因，以期为寻找内生真菌与外部环境的相关性提供一定的线索，也为内生真菌与不同产地杜仲药材品质差异的相关性研究奠定基础。 1材料 1.1样品采集2012年11月，分别在杜仲主产区：贵州遵义枫香镇、湖南慈利江垭林场、陕西略阳县天台村随机选取5棵7～8年生健康的杜仲树，在离地1～1.5 m高处，剥取新鲜干皮后置于无菌保鲜袋中，并于4 ℃保存备用。 1.2培养基[11]内生菌分离、纯化及菌种保藏均采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，液体发酵培养基采用马铃薯葡萄糖（PD）培养基。 1.3主要仪器与试剂SW-CJ-2D型净化工作台（苏州净化）、THA-3560C高压蒸汽灭菌锅（造鑫企业有限公司）、ZSD-1270型生化培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；QHZ-98B全温光照振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）；Motic BA-400数码成像光学显微镜（武汉麦克奥迪仪器仪表有限公司）。 琼脂粉（福建泉州市泉港化工厂，批号 座机电话号码）、葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，批号F座机电话号码）、次氯酸钠溶液（广东光华科技股份有限公司，批号 座机电话号码）；CTAB，β-巯基乙醇，Tris，冰醋酸，氯化钠（均为国产试剂）；自制超纯水。 2方法 2.1内生真菌的分离、纯化及保藏[11-12]取3个产地的杜仲皮适量，先用水冲洗外表至干净，滤纸吸干表面的水分。用无菌刀将样品切割成约3 cm×3 cm的小块，在75%乙醇溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗样品表面3次，无菌滤纸吸干；再用5.5%次氯酸钠溶液浸泡3 min后，用无菌水冲洗样品表面5次，无菌滤纸吸干。用镊子及解剖刀刮去栓皮层，取其中心韧皮部约0.4 cm2的小块，贴于PDA培养基的表面，每皿放2块材料，于28 ℃恒温培养箱内培养3～10 d。待菌丝从植物组织长出后，及时从边缘挑取菌丝移至新的PDA平板上，采用菌丝顶端纯化法对分离出的菌种逐步进行纯化。纯化后的菌种接种于PDA斜面试管上，并放4 ℃保存。把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于PDA平板上，作为漂洗检验对照；将上述表面灭菌处理的组织块贴于PDA平板上，使其与培养基接触20 min后，移去植物材料，作为组织印记对照，于相同条件下培养、观察，以确保表面灭菌彻底，分离出的为内生菌。 2.2形态